胰腺癌循环肿瘤细胞检测及其临床应用

余 倩 姜立新

胰腺癌的转移和复发是影响肿瘤患者长期存活的最主要因素，在转移的过程中，原发肿瘤细胞可通过多种途径侵入到血液循环系统中，产生循环肿瘤细胞 (CTCs)。这些细胞以单个或聚集成团的形式存在，部分CTCs作为肿瘤转移的种子，在脱离原发病灶后能够抑制失巢凋亡，在血液循环中抵抗流体剪切力和躲避免疫监视，具有在机体其他部位附着形成新的癌转移灶的潜能[1]。CTCs有原发灶细胞的生物学特性，因此被认为在反映癌症恶性程度及预后方面有重要的应用潜能。研究表明，CTCs的检测结果、细胞计数、特定表面标志物识别与胰腺癌患者的诊断及分期、疗效判断和预后显著相关，能够为胰腺癌的个体化诊疗提供可靠依据[2]。

一、胰腺癌CTCs体外检测

胰腺癌CTCs进入血液循环后，绝大部分会受到失巢凋亡，流体剪切力和机体免疫识别杀伤作用的影响，最终在外周血中存活的CTCs数量稀少(约每109～1010个血细胞中有1～10个CTCs)。体外检测又被称为“液体活检”，主要通过采集血样，对CTCs进行计数及亚群特征分析。主要的分离检测方法可分为免疫介导法和分子法(主要为PCR介导的检测)两大类[3]。此外，利用密度梯度离心和基于细胞尺寸的物理法分离，可对血样中微量的CTCs进行富集，从而提高检测敏感度[4]。

1.免疫介导法检测胰腺癌CTCs：基于抗原-抗体结合反应的免疫学方法以其特异性、有效性，在胰腺癌CTCs检测中发挥了重要作用。胰腺癌为上皮组织来源肿瘤，在其细胞表面表达特殊的表面分子，而血液中的红细胞和白细胞则几乎不表达上皮来源的表面分子。最常见的选择性标志物为上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)。

CellSearch系统是唯一受美国食品药品监督管理局(FDA)批准的，用于患者体内CTCs分离检测的技术，该技术是一种自动化的CTCs免疫富集和染色的系统。检测过程中，偶联有EpCAM抗体的磁珠捕获CTCs，通过磁珠分选将其富集[5]。然后固定富集的细胞并用DAPI、CK和CD45染色，通过CellSpotter分析仪(Veridex)将CK+、DAPI+、CD45-细胞计数为CTCs。

Hugenschmidt等[6]通过CellSearch系统检测可切除的胰腺癌和壶腹周围癌患者外周血CTCs与疾病预后，结合患者术后病理分析，高风险患者CTCs阳性(≥1/7.5ml)占6.8%(10/147)，晚期患者CTCs阳性占6.2% (2/33)，低风险和良性肿瘤患者CTCs均为阴性，尽管成功切除肿瘤，但术前CTCs阳性的患者仍显示出不良预后。Okubo等[7]通过CellSearch系统检测不可切除的胰腺癌患者外周血CTCs与疾病预后，CTCs阳性患者(21/65)总生存率明显低于阴性患者，且伴有肝转移的胰腺癌患者CTCs数量明显增多，研究表明CTCs可预测晚期胰腺癌患者化疗预后和治疗反应。

微流体芯片技术(CTC-Chip)是基于EpCAM阳性选择的另一种检测方式，Nagrath等[8]于2007年首次报道，CTC-Chip由一系列具有EpCAM抗体的微柱组成，当外周血样本流过芯片时，因抗原-抗体反应，肿瘤细胞被芯片捕获。Ko等[9]研制的CTCs荧光原位杂交芯片可实现分离并检测全血中的CTCs，该芯片将胰腺癌CTCs定义为RNA FISH(CK18+、CK19+、Ctnnd1+、CD45-)，并应用于胰腺癌小鼠模型及25例晚期胰腺癌患者血液标本中。

以上两种基于EpCAM阳性选择的胰腺癌CTCs检测方式也存在一定的局限性，由于肿瘤细胞的异质性及上皮-间质转化(EMT)等特性，并非所有肿瘤细胞都表达EpCAM抗原，这有可能会降低CTCs检测率。

免疫磁珠阴性富集可对胰腺癌CTCs进行阴性选择，将患者血样中的红细胞裂解后，通过使用表面带有白细胞特异性抗体(如CD45)的磁珠消耗胰腺癌患者血样中的白细胞，获得未标记的胰腺癌CTCs悬液。Zhang等[10]用抗CD45抗体消耗3.75ml血样中的CD45+细胞，并通过结合CK、CD45、DAPI和CEP8鉴定胰腺癌患者CTCs。该方法不受肿瘤细胞异质性及EMT特性影响，能够提高CTCs检测率[11]。

2.基于分子法PCR的胰腺癌CTCs检测：该方法将胰腺癌患者血样中肿瘤特异性mRNA高水平表达作为CTCs的替代标志物，通过将正常血样作为对照设定阈值，以便定量检测肿瘤特异性mRNA[12，13]。

Chausovsky等首次使用巢式实时定量PCR(nested RT-PCR)检测胰腺癌患者血样中CK20 mRNA的表达，79%(22/28)胰腺癌患者CK20扩增，22例正常对照者CK20扩增均为阴性。Zhou等[14]研究表明，多标记比单标记显示出更好的结果，对25例初诊胰腺癌患者进行人端粒酶反转录酶(hTERT)、C-MET、CK20和CEA的RT-PCR，检测阳性表达率分别为100%(25/25)、80%(20/25)、84%(21/25)和80%(20/25)。

基于PCR的胰腺癌CTCs检测具有较高的敏感度，但是由于并缺乏胰腺癌特异性mRNA，常用上皮特异性mRNA替代，因此敏感度往往会伴随着假阳性的出现。

二、胰腺癌CTCs体内检测

Lin的研究小组开发了一种用于CTCs检测的体内技术，称为活体流式细胞术(IVFC)，它结合了传统流式细胞术和共聚焦显微镜检测。活体检测的方法包括活体荧光流式细胞术(FFC)和活体光声流式细胞术(PAFC)：FFC的原理为当带有荧光标记的CTCs流经激光时，被激发的荧光被光电倍增管收集，产生不同于血液背景的信号，从而实现CTCs的活体检测[15]。PAFC利用生物组织的光声效应，当激光照射组织时，组织吸收光能量产生热膨胀，向外辐射超声波，通过分析超声换能器接收的不同声波信号来检测CTCs[16]。

IVFC可用于研究活体循环系统中胰腺癌CTCs在特定时间区间内的数量变化趋势，为疗效判断和预后提供依据。目前实验研究多采用胰腺癌细胞体外标记，注射入实验动物循环系统，或异种移植到实验动物体内，对胰腺癌CTCs变化趋势进行连续监测。研究表明，CTC簇比单个CTC有更大的转移潜能，IVFC检测CTC簇的荧光信号显示为多个峰，而单个CTC的荧光信号显示为单峰，CTC簇的信号比单个CTC具有更长的持续时间[17]。IVFC可以实时、定量地对胰腺癌CTCs进行活体检测，相较于体外检测方式，具有非侵入性、高敏感度和动态监测的优势，可用于研究胰腺癌发展、转移的CTCs动力学变化。

三、CTCs在胰腺癌诊疗中的应用

1.诊断和分期：Xu等[11]通过阴性富集，免疫荧光8号染色体原位杂交(NE-iFISH)来捕获和鉴定胰腺癌患者的CTCs，NE-iFISH系统在胰腺癌患者中表现出极高的CTCs检出率(90%)，结合CTCs≥2和CA19-9>37μmol/L，PC的诊断率可达到97.5%。

Ankeny检测了72例胰腺癌患者和28例其他胰腺疾病患者的CTCs，显示Ⅰ～Ⅱ期患者CTCs阳性率为54.84%(17/31)、Ⅲ期阳性率为78.57%(11/14)、Ⅳ期阳性率为96.30%(26/27)；28例其他胰腺疾病患者中仅1例检测出1个CTCs。统计表明可以将CTCs≥3个/4毫升作为Ⅳ期胰腺癌的评判标准，CTCs有望成为胰腺癌诊断和分期的生物学标志物。

2.疗效和预后:Torphy等[18]建立胰腺导管腺癌小鼠模型，随机分为两组，分别使用化疗药物和空白载体治疗28天，并于治疗前后检测CTCs，化疗组CTCs计数治疗后明显减少(26.61个/250微升 vs 2.21个/250微升,P=0.021)，而空白组治疗前后CTCs计数比较差异无统计学意义(23.26个/250微升 vs 11.89个/250微升,P=0.808)。CTCs的连续监测可以用作预测治疗反应的微创方法以指导治疗方案。

杨阳[19]通过检测48例胰腺癌患者术后外周血CTCs变化情况，探讨高强度聚焦超声消融(high-intensity focused ultrasound, HIFU)与开放手术两种治疗方法对胰腺癌细胞血行性播散的影响, 应用免疫磁珠负性富集结合免疫荧光原位杂交技术检测外周血CTCs。研究发现，开放手术和HIFU治疗均有可能发生医源性癌细胞血行播散，并且手术治疗CTCs检出率高于HIFU治疗，因此胰腺癌患者接受开放手术或HIFU治疗后，应酌情给予化疗、增强免疫力等辅助治疗。

四、展 望

CTCs诊断胰腺癌的敏感度低于EUS-FNA，但特异性(100%)与组织病理活检相当，具有低风险、低成本、高特异性等优点[20]。目前对胰腺癌CTCs的检测尚未形成统一指南，检测方法的差异使得研究之间的比较变得困难，并且在广泛采用之前，必须严格验证“可重复性”。未来的发展中，实现胰腺癌CTCs检测的标准化，需要更多独立验证研究以及在大型前瞻性临床试验中的严格评估。