阳离子光敏抗菌型水凝胶的制备及性能表征

董建成，葛孝栋，王清清，魏取福

(江南大学 生态纺织教育部重点实验室，江苏 无锡 214122)

近年来，细菌感染屡见不鲜，耐药性病株的出现使得人们对于一些感染病例束手无策，迫切需要开发新的抗菌剂及研究方法来解决这个问题。常用的抗菌剂有重金属[1]、季铵盐[2]、壳聚糖[3]等，但这些常规抗菌剂往往会产生耐药性。光动力抗菌化学疗法(photodynamic antimicrobial chemotherapy, PACT)[4]作为最具前景的新疗法之一，有望替代抗生素和常规抗菌剂用于感染方面的治疗。PACT基于光动力疗法(photodynamic therapy, PDT)，利用光敏剂在可见光的照射下产生光毒性单线态氧(1O2)灭活微生物。1O2没有特异性的靶目标，因此PACT在灭菌的过程中不易使微生物产生耐药性[5]。PACT常用的光敏剂有亚甲基蓝、卟啉类等，由于自身所带的正电荷使得其对细菌具有良好的抗菌效果[5]。将光敏剂固定化，为其持续和可重复利用提供了条件。目前，光敏剂在壳聚糖、硅胶、甲基丙烯酸衍生物等各种载体上的固定化已被广泛研究[6-7]。但关于阳离子光敏剂在水凝胶基材上的负载，其用于光动力抗菌方面的研究较少。相比于其他的材料，水凝胶具有良好的生物相容性、可加工性、特定的刺激响应性。用其作为基体材料可以通过多种方式实现光敏剂的固定化，在诸多领域具有广泛的用途[8]。

本工作首先通过MMT特有的层间阳离子交换性能，分别吸附3种阳离子光敏剂，然后将其均匀分散在PVA-SbQ溶液中，然后利用紫外光交联法，使SbQ基团发生光二聚反应，分子链之间发生交联，形成具有三维网络结构的水凝胶。分析光交联过程中光照时间对光敏剂性能的影响及水凝胶的溶胀性能，最后探究3种水凝胶对金黄色葡萄球菌的光敏抗菌效果。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

PVA-SbQ(苯乙烯吡啶盐的摩尔分数为4.1%)，上海广毅印刷器材科技有限公司；无机纳米蒙脱土，浙江丰虹新材料股份有限公司；亚甲基蓝(MB)、meso-四(1-甲基吡啶嗡-4-基)卟吩对甲苯磺酸盐(TMPyP)、meso-四(N-甲基-4-吡啶)卟吩四氯化锌(Zn-TMPyP)，上海维塔试剂有限公司；金黄色葡萄球菌(ATCC6538)，上海协久生物科技有限公司；PBS缓冲液(pH=7.4)，自制；去离子水，江南大学后勤管理中心。

1.2 紫外光交联法制备光敏抗菌型水凝胶

经反复超声处理配制0.1%(质量分数)的MMT溶液，然后分别取1mL浓度为100μmol/L的TMPyP，Zn-TMPyP，MB水溶液和1mL的MMT溶液加入烧杯，搅拌均匀后加入5mL质量分数为50%的PVA-SbQ水溶液，磁力搅拌30min后，将混合溶液转移到聚PTFE培养皿中。在培养皿上方覆盖一层保鲜膜防止水分蒸发，最后将其放置在氙灯(配置365nm滤光片)下照射2h，得到光敏抗菌型水凝胶。

1.3 光敏剂光漂白测试

分别配制浓度为25μmol/L的TMPyP，Zn-TMPyP水溶液和50μmol/L的MB水溶液。以去离子水的吸收光谱作为基线，扫描波长范围为300～650nm。分别取4mL对应的光敏药物溶液在氙灯(配置365nm滤光片)下照射1～5h，每小时扫描一次溶液的吸收光谱。同样的方法，移除365nm滤光片，配置420nm滤光片(λ≥420nm)在氙灯下照射0～120min，每隔10min在波长420.7，434.8，664nm处测3种溶液的吸光度变化。

1.4 水凝胶溶胀性能测试

将所得3种水凝胶冻干膜裁剪成小块，每种水凝胶膜分为3个平行组。把水凝胶膜浸没在过量去离子水中，在25℃恒温水浴锅中放置，每隔1h取出水凝胶，用滤纸拭去表面的水分，然后在电子天平上称重，直至达到溶胀平衡。水凝胶溶胀比S为：

(1)

式中：WR，W0分别为每小时水凝胶吸水后的质量和干凝胶的质量。

1.5 抗菌测试

参考AATCC 100-2012对水凝胶光敏抗菌性能进行评价。在水凝胶冻干膜样品上剪取若干个形状、厚度均一的圆形试样，平铺于24孔板内。取0.1mL浓度为1×108～3×108CFU/mL的金黄色葡萄球菌菌液(PBS缓冲液)接种在各试样上。每个样品均分为两组，分别置于光照及暗室的环境下培养30min，随后在含有试样的对应的24孔板内加入0.9mL PBS缓冲液，混合均匀后将原菌液及试样上的菌液在离心管中依次等梯度稀释106倍，制作出10倍稀释系列。分别从稀释系列的各离心管中取10μL溶液注入含琼脂培养基的平板上，置于37℃的恒温培养箱中培养24h。最后对其菌落数测定，计算出细菌存活率，对抗菌效果进行评价。

1.6 其他分析测试

用S-4800型扫描电子显微镜进行水凝胶表面形貌分析；用JEOL-2010型透射电子显微镜对MMT和水凝胶进行表征；用Q500热重仪分析水凝胶的热性能(升温速率为10℃/min，最高温度为600℃)。

2 结果与分析

2.1 水凝胶的形貌结构

图1为TMPyP，Zn-TMPyP和MB 3种光敏剂的水凝胶的实物图与SEM图。由图1(a-1),(b-1),(c-1)可知，水凝胶的外观均质透明，匀整统一，3种水凝胶均呈现出光敏剂特征的颜色属性。MMT通过层间阳离子交换作用吸附光敏剂[9]，避免了光敏剂团聚现象的产生[10]，这是均质水凝胶成型的基础。

图1 TMPyP(a)，Zn-TMPyP(b)和MB(c)水凝胶的实物图与SEM图(1)实物图；(2)纵切面；(3)横切面Fig.1 Digital images and SEM images of TMPyP(a),Zn-TMPyP(b) and MB(c) hydrogels(1)digital images;(2)longitudinal sectional images;(3)cross sectional images

由图1(b-2)，(c-2)纵切面观察到，水凝胶具有联通的多孔三维网络结构，图1(b-3),(c-3)的横切面形成连续的片层结构，MMT/TMPyP水凝胶电镜图尤为明显。这是由于在冷冻过程中，凝胶中的水在低温条件下成核结晶，形成冰峰，随着热量的传递，冰峰逐渐接近凝胶表面，形成贯通的冰柱，低压条件下冰柱干燥升华，形成水凝胶的多孔结构[11-12]。这种多孔结构极大增加了水凝胶的比表面积，有利于光敏剂的释放及其与底物接触。

图2为MMT，MMT/TMPyP水凝胶的TEM图。

从图2(a)中可以看出，经过超声处理后，MMT片层结构被撑开，显示出MMT的片层条纹结构，颜色较深的是MMT片层，颜色较浅的为片层间隙[13]。图2(b)中吸附TMPyP的片层MMT均匀分散在PVA-SbQ载体中，从微观层面说明了图1中均质稳定水凝胶的成型。

图2 MMT(a)，MMT/TMPyP(b)水凝胶的TEM图Fig.2 TEM images of MMT(a) and MMT/TMPyP(b) hydrogels

2.2 光敏剂的光漂白

图3为3种光敏剂的紫外光及可见光漂白曲线。光漂白是指光敏剂与光子相互作用时，除生成1O2外，还会伴随着发生光降解、光缔合等其他光化学副反应[14]，破坏光敏剂的分子结构，降低光敏化能力。图3(a)，(b)，(c)分别为TMPyP，Zn-TMPyP，MB的紫外光漂白曲线。可以看出，即使经过5h的紫外光照射，光敏剂的吸收曲线均没有发生明显降低，保证了水凝胶制备过程中光敏剂的光敏化性能。

图3(d)为3种光敏剂的可见光漂白曲线。可知，在可见光照射下(λ≥420nm)，3种光敏剂均发生部分光降解。两种卟啉类光敏剂较为稳定，而MB光降解达到49.7%。MB是氮硫杂蒽化合物形成的三环状结构，而卟啉是由26个π电子形成的高度共轭大环结构，因此卟啉的稳定性高于MB。与TMPyP相比，Zn-TMPyP中Zn2+的存在使得卟啉环在与光子的相互作用中更容易产生电子跃迁[15]，因此Zn-TMPyP的降解速率高于TMPyP。

图3 TMPyP，Zn-TMPyP和MB光敏剂的紫外光及可见光漂白曲线(a),(b),(c)TMPyP，Zn-TMPyP，MB的紫外光漂白曲线；(d)3种光敏剂的可见光漂白曲线Fig.3 UV bleaching curves and visible light bleaching curves of the TMPyP，Zn-TMPyP and MB photosensitizers(a),(b),(c)UV bleaching curves of the TMPyP,Zn-TMPyP and MB;(d)visible light bleaching curves of the three photosensitizers

2.3 水凝胶的溶胀性能

图4为3种光敏水凝胶的溶胀性能曲线。可知，3种水凝胶的溶胀趋势基本一致，随着时间的增加，溶胀速率都呈线性增长，12h后基本达到溶胀平衡，3种水凝胶平衡溶胀比迥异。溶胀过程中，水分子从外部渗透到水凝胶体系内，使其溶胀，同时聚合物分子链的扩展使三维网络结构受到应力作用，使分子网产生收缩趋势，当两种相反的倾向相互抵消时，达到了溶胀平衡[16-17]。3种水凝胶的平衡溶胀比大小不同，可能与光敏剂分子量大小相关。TMPyP，Zn-TMPyP和MB分子量依次降低，与MMT结合后形成的粒径大小也依次降低，因此MMT/PS在水凝胶中填充的网络空隙大小不同，当水凝胶浸没在水中时，部分MMT/PS会脱离出来，对应的网络空隙由水分子填充。TMPyP，Zn-TMPyP和MB水凝胶的网络空隙逐渐减小，因此对应溶胀比依次减小。

图4 3种光敏水凝胶的溶胀性能Fig.4 Swelling property of the three photoactive hydrogels

2.4 水凝胶的热学性能

图5 3种光敏水凝胶的TGA曲线和TMPyP水凝胶的DTG曲线Fig.5 TGA curves of the three photoactive hydrogelsand DTG curve of the TMPyP hydrogel

2.5 水凝胶的光敏抗菌性能

图6为3种光敏水凝胶对金黄色葡萄球菌的抗菌效果。可以看出，水凝胶对金黄色葡萄球菌均具有一定的杀灭效果。在光照及暗室培养环境下，对照组均未产生抗菌效果，而复合了光敏剂的Zn-TMPyP，TMPyP和MB水凝胶，在可见光照射条件下(λ≥420nm)细菌的存活率分别为1.51%，47.26%，74.58%，对应光敏剂游离时的1O2量子产率分别为0.88，0.74，0.49[20]。光敏剂的1O2量子产率越高，其光动力抗菌效果越佳，然而光敏剂被负载后光敏化性能下降[5]。负载MB的水凝胶光敏抗菌性能较差，可能是由于30min光照使其部分光降解，导致其光敏化能力降低。光照30min后，2种卟啉光敏剂的降解率较低，但TMPyP水凝胶的杀菌效果一般，可能是因为其1O2量子产率低于Zn-TMPyP，被负载后量子产率进一步降低。Zn-TMPyP对金黄色葡萄球菌的杀灭效果达到98.49%，具有最好的抗菌效果。一方面是因为高1O2量子产率，另一方面，Zn-TMPyP中Zn2+对细菌有一定杀灭效果。在暗室条件下，水凝胶有一定的抑菌效果，这可能是由于光敏剂穿透细菌细胞壁，进入细胞内对细菌DNA产生损害导致细菌裂解所致[21]。

图6 3种光敏水凝胶对金黄色葡萄球菌的抗菌效果Fig.6 Antibacterial effects of the three photoactive hydrogels against staphylococcus aureus

3 结论

(1)成功制备了TMPyP，Zn-TMPyP和MB 3种阳离子光敏抗菌水凝胶。其外观均质透明、匀整统一。制备过程中，紫外辐射不会影响光敏剂光敏化性能，冷冻干燥后内部形成联通的三维网络多孔结构，具有良好的溶胀性能。

(2)3种光敏水凝胶热分解性能基本一致，光敏剂的存在不会影响载体热学性能。

(3)Zn-TMPyP水凝胶具有最佳的光敏抗菌效果，其对金黄色葡萄球菌的杀灭效果达到98.49%，另外2种水凝胶也具有一定的抑菌效果。