Apelin 抑制小鼠气道平滑肌细胞增殖的作用及机制

吴媛媛 孙秀珍 刘昀 陈海娟

西安交通大学第二附属医院（西安710004）

支气管哮喘是一种常见的呼吸道慢性疾病，其病因复杂，以气道慢性炎症和气道高反应性为特征［1］。气道慢性炎症导致气道重塑是不可逆气流形成的主要病理基础，是难治性哮喘的主要病理机制，气道炎症除炎性细胞参与外，还涉及气道壁多种结构细胞，如平滑肌细胞、成纤维细胞和上皮细胞结构及功能的改变。小鼠气道平滑肌细胞（aiway smooth muscle cells，ASMCs）能够释放多种细胞因子及介质，促进细胞增殖，并与气道高反应性密切相关［2］，所以ASMCs 增生和肥大是气道重塑的主要因素。因此，研究ASMCs增殖的分子机制，为逆转哮喘气道重塑，探寻治疗哮喘的新靶点具有重要意义。

研究发现［3-4］，激活TGF-β/Smad 信号通路可以加快ASMCs 增殖，促进气道炎症，抑制TGF-β/Smad可以减轻OVA 诱导的哮喘小鼠气道炎症反应和重塑程度。Apelin 是一种血管活性多肽，其受体为孤儿G 蛋白耦联受体-血管紧张素受体AT-1 相关的受体蛋白（APJ），Apelin 及其受体APJ 在哺乳动物体内具有广泛的生物学效应，既调控机体的正常生理活动，亦参与疾病的发生发展。目前研究发现，apelin 与其受体APJ 结合，发挥抗炎、抑制血管平滑肌细胞增殖、舒张血管、降低血压等作用［5］，但在支气管哮喘中未见相关研究报道。因此，本研究将探讨apelin/APJ 是否具有抑制ASMCs增殖的作用及其具体的分子机制。

1 材料与方法

1.1 试剂和材料 胎牛血清和DEME培养基（美国Gibco 公司）；Lipofectamine 2000 转染试剂盒（美国invitrogen 公司）；APJ shRNA 质粒（上海吉玛制药技术有限公司）；BrdU试剂盒（美国Abcam）；PDGF（美国Peprotech）；兔抗小鼠β-actin、TGF-β1、Smad3、p-Smad3、p27 蛋白抗体（Cell Signaling Technology）；羊抗兔二抗（北京博奥森）；Apelin多肽（北京博奥森）；酶标仪（美国Bio-TekELX808IU）；Western blot 电泳及转膜系统（美国Bio-Rad）。

1.2 试验方法

1.2.1 分离和培养原代ASMCs BALB/c 小鼠，脊椎脱臼法处死，75%乙醇中浸泡消毒。固定小鼠，取出完整的气管与肺组织。把取出的组织放置在体视显微镜下，浸泡在含有1%青-链霉素的PBS中，剪去食管及其余组织。剥离气管内外膜及软骨，可见中部平行条纹的气管平滑肌组织，并将其分离、剪碎，应用组织块贴壁法，于37 ℃、5% CO2条件下培养，当细胞长至80%～90%融合时进行传代。所有实验均在4～6 代进行。

1.2.2 BrdU 法检测细胞增殖 取第4～6 代对数生长期的ASMCs 接种96 孔板，经过孵育、饥饿，使细胞生长同步化；然后加入干预试剂，继续培养；随后加入BrdU 标记液孵育、清洗；加入抗BrdUPOD 工作液孵育，清洗后加入底物溶液，再经孵育，最后在多功能酶标仪上读数。

1.2.3 siRNA转染细胞 对数生长期的细胞，以3×105个细胞/孔密度接种于6 孔培养板，细胞达到约50%～60%融合，按Lipofectamine 2000转染试剂盒说明将APJ siRNA和control siRNA分别转染细胞48 h。

1.2.4 Western blot 检测TGF-β1、Smad3、p27蛋白表达水平 收集细胞加入细胞蛋白裂解液0.5 mL 匀浆，4 ℃、12 000×g离心15 min，取上清液测蛋白浓度；蛋白煮沸5min 变性后，经12% SDSPAGE 电泳，电转移至PVDF 膜上，在5%脱脂奶粉-PBST 溶液室温下封闭1 h，加入TGF-β1、Smad3、p27 和GAPDH 抗体；抗体在4 ℃孵育过夜，洗膜后，加入二抗，37 ℃，1 h；暗室发光。

1.3 统计学方法 所有统计分析均釆用统计软件SPSS 16.0 进行分析。计量数据以均数士标准差表示，组间比较用方差分析，P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Apelin 可以有效抑制PDGF 刺激的ASMCs增殖 将ASMCs 分为对照组、PDGF 刺激组和PDGF+apelin 处理组。Apelin（1 nmol/L）在PDGF（20 ng/mL）干预前30 min 加入孵育。在PDGF 刺激72 h 后，用BrdU 法检测细胞增殖的增殖效应。与对照组相比较，PDGF（20 ng/mL）能够显著刺激ASMCs 增殖，BrdU 的掺入率是对照组的2.71 倍，而apelin（1 nmol/L）可以逆转PDGF 刺激细胞增殖的作用，BrdU 的掺入率降至1.36（P＜0.05，图1）。

图1 Apelin 抑制PDGF 刺激细胞增殖的作用Fig.1 The inhibition effect of apelin on PDGF-induced ASMCs proliferation

2.2 Apelin 通过抑制TGF-β/Smad 信号通路，上调p27 蛋白，进而抑制PDGF 诱导的ASMCs 增殖 ASMCs 分组同上。收集细胞，提取总蛋白，用Western blot 检测各组细胞中TGF-β1、p-Smad3、p27 蛋白水平。结果显示与对照组相比较，PDGF刺激组中，TGF-β1 和p-Smad3 水平明显升高（P＜0.05，图2A、2B），而反应细胞周期负性调控因子p27 蛋白水平降低（P＜0.05，图2C）。Apelin 可以降低PDGF 升高TGF-β1、p-Smad 水平，降低p27 水平的作用。由此得出，apelin 通过抑制PDGF 激活TGF-β1/Smad 信号通路的作用，进而抑制ASMCs增殖。

图2 Apelin 抑制细胞增殖的分子机制Fig.2 The mechanisms of apelin on PDGF-induced ASMCs proliferation

图3 Apelin/APJ 抑制细胞增殖的作用及机制Fig.3 The inhibition effect of apelin/APJ on ASMCs proliferation

2.3 Apelin 通过与其受体APJ 结合发挥抑制PDGF 刺激ASMCs 增殖的作用 为进一步验证APJ 在apelin 抑制ASMCs 增殖中的作用，转染APJ shRNA，再次应用BrdU 法评估细胞的增殖效应，Western blot 检测各组中TGF-β1、p-Smad3、p27 蛋白表达。结果显示，沉默APJ 可逆转apelin 抑制ASMCs 增殖，BrdU 掺入率从1.24 升至2.52；沉默APJ 可抑制apelin 降低TGF-β1、p-Smad3 水平、升高p27 蛋白表达的作用（图3）。以上结果提示，apelin依赖于APJ受体发挥抑制ASMCs 增殖的作用，具体为通过抑制TGF-β/Smad信号通路活化而实现。

3 讨论

支气管哮喘是一种以气道慢性炎症、气道高反应性、气道重塑为特征的呼吸系统慢性疾病。气道重塑是指气道结构细胞功能改变、炎症细胞浸润、杯状细胞增生导致黏液分泌增加、细胞外基质沉积导致气道结构改变，引发不可逆性气流受限。气道重塑与哮喘预后不良密切相关，直接影响患者病情转归。ASMCs 在气道重塑中发挥着重要作用。因此，研究ASMCs 增殖的分子生物学机制对哮喘治疗尤为重要。PDGF、TNF-α、TGF-β 等多种细胞因子均参与ASMCs 增殖［6］，本研究选用PDGF 作为刺激因素构建ASMCs 增殖模型。

Apelin 是1998年从牛胃中分离出来的血管活性多肽，其受体为APJ。Apelin的基因位于X染色体的q25-26.1，由含3个外显子的1 726个碱基对构成，编码77 个氨基酸前蛋白。APJ 含377 个氨基酸，具有7 个跨膜单位，与Gi 蛋白偶联。APJ 受体基因位于11 号染色体q12 带［7］。Apelin 及其受体APJ 的mRNA及蛋白广泛存在于哺乳动物与人的多种组织（脑、肺、心脏、血管等）中，目前研究［5］发现apelin与其受体APJ 结合，具有抗炎、抑制细胞增殖、舒张血管、降低血压等作用。在本研究中，apelin能够有效抑制PDGF 诱导的ASMCs 增殖，沉默APJ 能够逆转apelin抑制PDGF诱导的ASMCs增殖。

TGF-β/Smad 具有强烈的促纤维化作用，能刺激ASMCs 增生，在气道重塑中发挥作用［8］。研究报道，哮喘患者BALF 中TGF-β1 水平较正常组明显升高，且与其下游信号通路TGF-β1/Smad 活化成正相关［9］。SCHULIGA 等［10］研究发现，TGF-β1可刺激ASMC 分裂与增殖，使收缩蛋白表达增加、肌动蛋白骨架重构及基质重构等。TGF-β作为启动和维持气道重塑的潜在关键因子不仅参与上皮间质转化以及成纤维细胞分化等气道重塑相关途径，还可激活多条细胞内信号转导途径（如Smad蛋白介导的信号转导途径、磷脂酰肌醇3 激酶途径等）从而影响细胞周期的正常进行，导致气道重塑的发生［11］。p27 蛋白是为细胞周期负性调控因子，具有阻止细胞通过G1/S 期转换的作用，从而抑制细胞增殖［12］。为进一步研究PDGF刺激ASMCs增殖的分子机制，应用Western blot检测各组中TGF-β1、p-Smad、p27 蛋白表达水平，结果显示在PDGF 干预组中，TGF-β1、p-Smad水平降低，而p27蛋白水平表达升高；apelin 可以通过抑制TGF-β/Smad 信号通路活化进而抑制ASMCs 增殖，但沉默APJ 能够逆转apelin 对TGF-β/Smad 的抑制作用。本研究表明，APJ 介导apelin 逆转PDGF 对TGF-β/Smad 信号通路的激活作用，从而为通过抑制ASMCs增殖进而治疗难治性哮喘提供了新的策略和思路。