共生菌对小鼠外周血及黏膜相关组织中趋化因子配体24和胰岛素样生长因子1表达的调控

程民,陈稳,毛菊,杨雯雯,徐婷娟,沈国栋,吴新春,胡世莲

[中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)，安徽省老年医学研究所，肿瘤免疫与营养治疗安徽省重点实验室,合肥 230001]

呼吸道、消化道等黏膜组织中存在着大量的“共生菌”，共生菌在维持肠道、肝脏及肺脏等组织器官免疫系统稳态过程中发挥极其重要的作用，共生菌群改变与感染性疾病、肿瘤、哮喘及遗传性过敏症等易感性密切相关。趋化因子配体24(CCL24)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)等细胞因子在机体免疫调节、免疫应答、器官发育及代谢等过程中发挥重要作用，共生菌群对机体CCL24、IGF-1表达水平的调控是值得研究的科学问题，本研究通过检测小鼠外周血、肺脏、肝脏中CCL24及IGF-1的表达情况，进而探讨共生菌群对上述因子表达的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 C57BL/6小鼠(5～6周龄，雌性，SPF级)购自上海斯莱克实验动物责任有限公司，22 ℃、55%湿度、12 h昼/夜节奏条件下饲养。小鼠的饲养和实验操作过程遵循中国科学技术大学实验动物管理规范条例执行。

1.1.2 抗菌药物 万古霉素、新霉素、氨苄青霉素和甲硝唑均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 组织匀浆试剂 PBS磷酸盐缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司，TritonX-100溶液购自生工生物工程股份有限公司，蛋白酶抑制剂购自Roche公司。

1.1.4 ELISA试剂盒 Mouse IGF-1 ELISA kit购自RayBiotech公司，Eotaxin-2 (CCL24) mouse ELISA kit购自abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 共生菌缺失小鼠的构建 使用含有组合抗菌药物的饮用水连续饲喂C57BL/6小鼠4～6周，构建共生菌缺失小鼠模型[1]。饲喂期间观测小鼠体质量变化、活动状态等，对体质量降低严重(下降超过30%)的小鼠进行安乐死。实验过程中设立对照组，使用不含抗菌药物的饮用水进行饲喂。

1.2.2 匀浆缓冲液配制 取PBS溶液20 mL(pH值：7.25)，加入蛋白酶抑制剂混合片2片，TritonX-100溶液20 μL，振荡混匀至蛋白抑制剂完全溶解，冰上放置，备用。

1.2.3 血清标本获取 取实验组与对照组小鼠各6只，摘除眼球取血，收集血液至1.5 mL无菌Ep管中，4 ℃放置3～4 h，之后3 000 r/min，4 ℃，离心10 min，将上清液(血清)转移至0.5 mL无菌Ep管中。

1.2.4 组织匀浆液制备 上述小鼠(1.2.3中小鼠)摘眼球取血后，脱臼处死，解剖小鼠，小心分离肺脏、肝脏组织，去除血液、残余血管及结缔组织后，称重。肝脏、肺脏组织按100 mg∶300 μL的比例加入相应体积的匀浆缓冲液，并在无菌玻璃匀浆器中进行匀浆，将匀浆液移入 1.5 mL 无菌Ep管中，3 000 g，4 ℃，离心 10 min。吸取上清液，分装至0.5 mL无菌EP管中，-80 ℃保存，备用。

1.2.5 CCL24及IGF-1蛋白浓度检测 利用ELISA方法按照试剂盒说明书方法检测小鼠血清、肝脏及肺脏组织匀浆液中CCL24与IGF-1蛋白的浓度，每个样品设3个重复孔。

2 结果

2.1 血清、肺脏、肝脏组织中CCL24的表达情况 结果显示，共生菌缺失小鼠血清、肺脏及肝脏组织匀浆中CCL24的浓度分别为(1.509±0.119)μg/L、(14.626±0.769)ng/g、(8.704±0.458)ng/g，正常小鼠血清、肺脏及肝脏组织匀浆中CCL24的浓度分别为(1.018±0.043)μg/L、(11.984±0.683)ng/g、(11.575±0.609)ng/g。两组各项指标比较，P均<0.05(图1)。

注：WT为正常小鼠，Abx为共生菌缺失小鼠；** P<0.01，*P<0.05

2.2 血清、肺脏、肝脏组织中IGF-1的表达情况 共生菌缺失小鼠血清、肺脏及肝脏组织匀浆中IGF-1的浓度分别为(1.250±0.066)μg/L、(1.290±0.031)ng/g、(1.112±0.027)ng/g，正常小鼠血清、肺脏及肝脏组织匀浆中IGF-1的浓度分别为(1.240±0.019)μg/L、(0.998±0.024)ng/g、(2.989±0.073)ng/g。共生菌缺失小鼠血清中IGF-1蛋白的表达水平与正常小鼠血清相比较，差异无统计学意义(P>0.05)、肺脏组织匀浆中IGF-1蛋白的水平明显高于正常小鼠肺脏组织匀浆(P<0.05)，但共生菌缺失小鼠肝脏组织匀浆中IGF-1的浓度却明显低于正常小鼠(P<0.01)(图2)。

注：WT为正常小鼠，Abx为共生菌缺失小鼠；** P<0.01，*P<0.05

3 讨论

呼吸道、消化道、泌尿生殖道、皮肤等黏膜组织中存在着大量的微生物，这些对人体有益的微生物被称为“共生菌”。共生菌在维持黏膜免疫系统稳态中发挥着重要的作用，共生菌与免疫系统之间存在错综复杂的关系与精妙的平衡[2-3]。共生菌在维持肠道黏膜稳态过程中发挥至关重要的调控作用，可以调控免疫细胞的活性，并能刺激肠黏膜上的淋巴组织的发育。肝脏因与肠道特有的解剖学位置关系，肝脏免疫学特性与黏膜免疫系统之间存在诸多相似之处，共生菌对肝脏免疫细胞的组成及功能亦有显著影响。呼吸道内也存在着大量的共生菌，对肺脏局部黏膜免疫应答亦具有重要的调控作用。黏膜及其相关组织亦是肿瘤好发部位，肺癌、肝癌、肠癌等均是危害人类健康的严重问题，共生菌信号对机体抗肿瘤免疫应答的影响是值得深入探讨的科学问题。

CCL24是属于CC趋化因子家族的细胞因子通过CCR3受体相互作用，募集嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、Th2细胞及中性粒细胞等，在过敏性炎症中起重要作用，并与原发性结肠直肠癌、肺脏及肝脏转移瘤等密切相关[4-5]。胰岛素样生长因子1(IGF-1)是一种分子结构类似于胰岛素的活性蛋白多肽物质，通过与其特定受体结合，可以调节机体细胞的生长、发育、增殖及凋亡等，参与机体组织器官发育、生长、血糖调节、细胞分化等生理过程，同时在机体感染、肿瘤发生发展、创伤修复等病理过程亦发挥重要作用[6-8]。

本研究通过ELISA方法检测万古霉素、新霉素、氨苄青霉素及甲硝唑等四种抗菌药物联合饲喂4～6周后的共生菌缺失小鼠及正常小鼠血清、肺脏、肝脏中CCL24及IGF-1的表达情况，结果发现，共生菌缺失小鼠血清中CCL24的表达水平较正常小鼠血清明显升高(P<0.01)，IGF-1的表达水平无明显区别(P>0.05)；肺脏中CCL24、IGF-1的表达水平均明显高于正常小鼠(P<0.05)，但肝脏中CCL24、IGF-1的水平却明显低于正常小鼠(P<0.05)(图1，2)。上述结果表明共生菌群可以调控外周血、肺脏、肝脏组织中CCL24及IGF-1的表达水平，该调控作用调控具有组织特异性，本研究结果为进一步探索共生菌与机体相互作用及作用机制提供了新的依据和参考。