西藏拉萨市鸡源沙门氏菌分子生物学鉴定与血清分型

王 燕，刘会杰，马弘财，曾江勇，元振杰

（西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏拉萨 850009）

沙门氏菌是一种可以引起人和动物腹泻的病原菌，也是一种常见的食源性致病菌，禽蛋、家禽和肉类产品是其主要传播媒介，人类食入被沙门氏菌污染的食品，可引发公共卫生事件，因此做好沙门氏菌流行调研、分离鉴定，了解其血清型分布，具有重要的公共卫生意义。血清型是沙门氏菌的重要分类依据[1-2]，是研究沙门氏菌流行情况和进行公共卫生检测的重要参数，及时了解和掌握养殖动物中的沙门氏菌血清型分布，对研究沙门氏菌流行态势及其追踪溯源具有重要价值[3]。

沙门氏菌血清型由菌体抗原（O）、鞭毛抗原（H）和荚膜抗原（Vi）决定，而O和H抗原是绝大部分沙门氏菌属血清型鉴定的物质基础[3]。本研究选择拉萨市养鸡业相对集中的城关区、曲水县、达孜县、墨竹工卡县、堆龙区5个县（区），选择12个具有代表性的规模养鸡场进行采样检测，开展沙门氏菌分子生物学鉴定，并利用菌体抗原（A-F）诊断血清，做鸡源沙门氏菌血清分型试验，同时设计致病性试验，以期为西藏地区沙门氏菌病防控提供参考。

1 试验材料

1.1 主要仪器

恒温培养箱：美国SHELLAB公司，型号SMI7-2；生物安全柜：青岛海尔生物医疗股份有限公司，型号HR40-IIA2；全自动纯水仪：四川优普超纯科技有限公司，型号UPS-III-40；

高速冷冻离心机：Thermo Fisher，型号ST40 ST40R；PCR仪：BIO-RAD，型号C1 000 TM Thermal Cycler；电泳设备：BIO-RAD；全自动凝胶成像系统：BIO-RAD，型号Gel Doc XR+；光学显微镜：Leica，型号DM3000 LED；全自动高压蒸汽灭菌锅：CIRRUS-250。

1.2 主要试剂

沙门氏菌快速鉴别培养基、麦康凯培养基、LB培养基、伊红美兰肠杆菌、BS琼脂培养基：购自青岛海博生物公司；沙门氏菌生化编码微量鉴定管：购自杭州天和微生物试剂有限公司；沙门氏菌菌体抗原（A-F）诊断血清：购自杭州天和微生物试剂有限公司；沙门氏菌标准菌株：西藏农牧科学院畜牧兽医研究所微生物实验室提供；PCR反应试剂：购自宝生物公司。

1.3 被检样品

2017年3—4月，采集于拉萨市城关区、曲水县、达孜县、墨竹工卡县、堆龙德庆县12个集约化养鸡场的疑似沙门氏菌病发病鸡样品，共计121份。

2 试验方法

2.1 细菌分离培养

对病死鸡，解剖后采集病变组织；对发病商品鸡和种鸡，采集泄殖腔拭子；对环境用具等，采集表面拭子。采用无菌操作，取待检样品分别接种于沙门氏菌快速鉴别平板、麦康凯平板、伊红美兰平板、BS琼脂平板，37 ℃恒温培养18～24 h后，观察结果[4]。

2.2 细菌染色镜检

分别挑取单个可疑菌落，固定并进行革兰氏染色镜检[5]。

2.3 生化鉴定

根据《伯杰氏细菌鉴定手册》第九版和沙门氏菌编码生化鉴定管说明书要求，挑取培养好的新鲜菌落或菌液分别接种于赖氨酸脱羧酶、靛基质、尿素酶、氰化钾、硫化氢、山梨醇、甘露醇、水杨苷、丙二酸盐、卫矛醇、ONPG及葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、阿拉伯糖生化鉴定管，37 ℃恒温培养1 d[6-7]，观察并记录试验结果。

2.4 血清型鉴定

接照沙门氏菌属诊断血清说明书要求，首先将沙门氏菌接种于LB培养基，37 ℃培养16～18 h，离心后用灭菌生理盐水稀稀至规定浓度，取1滴沙门氏菌A-F诊断血清滴于洁净的玻片上，再加入1滴制备的沙门氏菌液，摇动玻片混匀，在5 min 内观察结果，发生凝集现象的即为阳性，同时设生理盐水和标准菌株对照[8-9]。用同样方法，依次用A（O2）、B（O4）、C1（O7）、C2（O8）、D（O9）、E（O3）的O血清做玻片凝集试验，确定血清群。

2.5 分子生物学鉴定

2.5.1 引物设计 根据Genbank中已发表的序列，参照文献[10]设计invA基因特异性引物，引物序列见表1。

2.5.2 模板制备 挑取单个菌落置于50 μL离心管内，加20 μL 双蒸水混匀，95 ℃水浴10 min，-20 ℃静置10 min，于 4 ℃ 12 000 r/min 离心2 min，取上清4 ℃保存备用。

2.5.3 PCR反应体系 反应体系为50 μL：DNA模板 1 μL，10×PCR 缓冲液（含 MgCl2）5 μL，dNTP 2 μL，P1、P2 各 1 μL，TaqDNA 聚合酶0.5 μL，dd-H2O 39.5 μL。

表1 invA基因引物序列

2.5.4 PCR 反应条件 94 ℃ 8 min；94 ℃ 40 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共进行34个循环；最后72 ℃延伸10 min。设不加DNA 模板的反应体系溶液作为空白对照。

2.5.5 PCR反应产物检测 配30 mL 1.5 %琼脂糖于微波炉完全溶化，加入3 μL溴化乙锭混匀，待冷至80 ℃时倒板，完全凝固后拔出梳子，每孔加PCR扩增产物3 μL，以溴酚蓝作指示剂，于0.5×TBE中130 V电压电泳30 min，检测扩增产物。

2.6 动物致病性试验

将120只7日龄健康雏鸡随机分为20组，每组6只。其中：18组分别皮下接种菌液，每只接种菌液0.2 mL（3×109CUF/mL）；2组为对照组，一组接种沙门氏菌标准株菌液（3×109CUF/mL），另一组接种生理盐水。接种后，每隔1 h，观察并记录鸡的临床情况[11]。

3 结果与分析

3.1 细菌分离

对所采集的121份样品进行细菌分离，共分离出109株细菌，其中符合沙门氏菌生长特征的107株。挑取单个菌落进行革兰氏染色镜检，发现所分离的细菌为革兰氏阴性、两端钝圆的短杆菌，长约1～5 μm，符合沙门氏菌特征（图1）。

3.2 生化鉴定

对所分离出的107株可疑菌株进行赖氨酸脱羧酶、靛基质、尿素酶、氰化钾、硫化氢、山梨醇、甘露醇、水杨苷、丙二酸盐、卫矛醇、ONPG及葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、阿拉伯糖试验，确定有104株符合沙门氏菌特征（图2）。

图1 鸡源性沙门氏菌革兰氏染色镜检形态（10×100）

3.3 血清型鉴定

对所分离的104株沙门氏菌进行血清型分型鉴定，发现这104株菌共属于4个血清群，其中A群（O2）13株、C1群（O7）29株、C2群（O8）9株、D群（O9）53株，优势血清群为D群（51%）和C1群（27%）。

3.4 分子生物学鉴定

对所分离的沙门氏菌进行PCR扩增，发现所分离菌株和标准阳性对照均扩增出invA基因片断，大小为372 bp，表明所分离的沙门氏菌为致病性沙门氏菌。空白对照组为阴性，无特异性条带出现（图3）。

3.5 动物致病性试验

雏鸡接种所分离到的细菌6 h左右开始发病，表现精神沉郁，不食或少食，8 h后开始腹泻，拉白色粪便，表明所分离的沙门氏菌具有致病性。接种后感染率达100%，生理盐水对照组感染率为0。

4 讨论

鸡源沙门氏菌病是鸡的常见传染病之一[12]，分为鸡白痢、鸡伤寒和鸡副伤寒[13]，严重影响种鸡受精率、种蛋孵化率、雏鸡成活率、饲料利用率和商品蛋的品质[14]，对养鸡业危害极大[15]，而蛋品和鸡肉质的好坏也关系到消费者健康。本研究在拉萨市养鸡密集的城关区、曲水县、达孜县、墨竹工卡县、堆龙德庆县5个县（区），选择有代表性的12个养鸡场疑似发病鸡采样，进行细菌分离鉴定和血清分型。

图2 鸡沙门氏菌生化鉴定结果

图3 沙门氏菌PCR鉴定结果

所有菌株呈A-F血清群凝集试验阳性，表明可能均为致病性沙门氏菌。目前拉萨市的优势血清群为D群（占51%），其次为C1群（占28%），另外还存在A群、C2群。动物感染试验显示，所分离的沙门氏菌能引起雏禽发病，也表明所分离的沙门氏菌为致病性沙门氏菌。沙门氏菌inv基因簇与沙门氏菌的致病性有关，决定了其通过肠粘膜侵入宿主上皮细胞的能力，其中invA是沙门氏菌的主要毒力因子，因此对invA基因的检测是识别致病性沙门氏菌的有效方法。

近几年来西藏旅游人数逐渐增多，导致高原畜禽产品需求增加，因而带动了畜禽养殖业的快速发展。但该地养鸡场饲养管理技术较滞后，仍采用过去的饲养管理方法，多数鸡舍环境卫生状况较差，通风不良，没有严格执行定期消毒制度，致使沙门氏菌等大量微生物在鸡舍环境中滋生，从而给当地的禽产品卫生安全带来威胁。因此，当地政府在大力发展规模化养殖业的同时，也要加大农牧技术培训力度，推进养殖设备、饲料、兽药、消毒剂等供销市场的建设。