人转铁蛋白的分离纯化及临床应用进展

何 洁, 郭采平

深圳市卫光生物制品股份有限公司, 广东 深圳 518107

1945年，Holmberg和Laurell首次在人血清中发现了一种非血红素结合铁的蛋白，将其命名为转铁蛋白(transferrin)[1]。人转铁蛋白是一种重要的β-球蛋白，是人血浆和组织细胞外空间的主要铁载体，主要负责把铁离子从吸收和储存的地方运输到红细胞供合成血红蛋白用，或输送到机体的其他需铁部位，在铁代谢过程中起着重要作用。正常情况下，人体中转铁蛋白的含量是相对稳定的，转铁蛋白在人体中的含量水平对机体健康具有重要的参考意义。

人转铁蛋白具有一系列的重要应用：由于转铁蛋白对铁特有的结合力从而具有抗氧化和抗菌的作用；还可作为无血清培养中的添加剂，促进细胞增殖；另外转铁蛋白在临床先天性无转铁蛋白性贫血、血色素沉积症、铁功能缺乏症、冠心病、局部出血、再灌注损伤、器官移植以及癌症等相关疾病治疗中有着重要的作用[2]。本文综述了转铁蛋白的结构特性和生理功能，以及其分离纯化工艺和临床应用进展，以期为未来转铁蛋白产品的研究开发提供参考。

1 人转铁蛋白的结构特性

人转铁蛋白是一个由679个氨基酸残基组成的单链糖蛋白，糖基含量约为分子量的6%，含有19个二硫键，分子量为79 kDa，等电点pI为5.9，由N端(336个氨基酸残基)和C端(343个氨基酸残基)两个具有高度同源性的结构域组成[3,4]，C端和N端结构域由一短肽连接，这两个结构域又由两个小亚基组成，这两个小亚基通过相互作用形成一个八面体结构的金属离子结合位点，能可逆地结合Fe3+，两端金属离子结合位点都有4个保守氨基酸，包括两个酪氨酸、1个天门冬氨酸和1个组氨酸(N端-Asp-63、Tyr-95、Tyr-188和His-249)，Fe3+与两个酪氨酸的氧原子、1个组氨酸的氮原子、1个天门冬氨酸的氧原子和碳酸阴离子中的两个氧原子通过配位键形成1个稳定八面体结构，1个转铁蛋白分子可以结合两个Fe3+，转铁蛋白还可结合其他金属离子，不过结合力相对弱一点[3,4]。

根据转铁蛋白结合Fe3+的数目及位点的不同，可将转铁蛋白分为4种类型：无Fe3+结合的脱铁转铁蛋白、N端结合Fe3+的单铁转铁蛋白、C端结合Fe3+的单铁转铁蛋白和结合两个铁离子的饱和铁转铁蛋白。在正常生理状态下，转铁蛋白对铁离子的结合力在pH 7.4时最高，结合常数约为1022，饱和度为30%左右[4]。铁饱和度低于20%，表明有铁缺乏的现象，而高于50%则意味着铁超载，超过80%则会出现非转铁蛋白结合铁的现象，会对组织造成损伤[5]。

2 人转铁蛋白的生理功能及作用机制

转铁蛋白在人血浆蛋白中含量为2～3 g/L，是血液中最主要的铁转运蛋白，可转运铁到红细胞中用于血红蛋白的合成或者其他快速分裂的细胞，还可结合饮食吸收的铁以及巨噬细胞释放的铁，在铁代谢中起着非常重要的作用[6]。当体内转铁蛋白含量低于0.1 g/L，容易发生致病菌感染、生长迟缓以及贫血等疾病[7]。虽然转铁蛋白是铁代谢过程中最重要的蛋白，但转铁蛋白结合的铁只有3～4 mg左右，约占人体内总铁量的0.1%，60%～70%的铁存在于血红细胞腔室中，其他铁存在于其他蛋白，如铁蛋白和肌红蛋白等。正常生理情况下，转铁蛋白铁转运是高度动态的，每天约30 mg的铁转运到细胞中，体内铁存储情况也是高度稳定的，每天只会损失1～2 mg铁，铁平衡可通过日常饮食摄入保持[8,9]。在铁代谢的过程中，发现由肝细胞合成的肝杀菌肽是维护体内铁平衡的一种重要因子，能够调节血浆铁浓度。肝杀菌肽含量升高时，血浆铁浓度降低，容易导致贫血。相反，则会引起血浆非转铁蛋白结合铁含量升高。目前已有研究表明，转铁蛋白的功能不仅仅是转运铁，还会与转铁蛋白受体结合，诱导肝杀菌肽的表达，从而进一步调节铁代谢[10～12]。

转铁蛋白主要在肝脏中合成，是一种急性蛋白，转铁蛋白含量能反映人体的健康状况。发生炎症时，转铁蛋白会抑制性表达。在怀孕过程中，转铁蛋白会升高。缺铁性贫血情况下，转铁蛋白的饱和度降低。在某些疾病或者处理条件下，转铁蛋白的铁结合能力超载，会有转铁蛋白未结合的游离铁，导致非血细胞里面的铁累积，从而对心脏、肝脏以及其他器官产生严重损伤[13,14]。

转铁蛋白转运铁是通过网格蛋白(clathrin)介导的细胞内吞作用来运行的(图1)。首先饱和转铁蛋白与细胞表面的转铁蛋白受体结合，然后由网格蛋白介导内吞作用，发出内吞信号，形成内涵体(endosome)。之后通过质子化降低内涵体的pH，铁就会被释放出来用于血红蛋白的合成或者以铁蛋白的形式储存起来。最后无铁的脱铁转铁蛋白就从转铁蛋白受体表面释放到血液中，从而进行下一循环的铁转运。一个转铁蛋白的分子在其生命周期内(半衰期约8天)可进行数百次的循环[15]。

3 人转铁蛋白的制备工艺

3.1 血液制品纯化背景

血液制品是全球生物医药产业发展的重要组成部分，国际上血液制品的开发主要依靠三种纯化方法：盐析法、低温乙醇法和层析分离法。早期开发的盐析法得到的血浆蛋白纯度低；20世纪40年代，Cohn[16]发明了低温乙醇法提取血浆蛋白，大大提高了纯度和收率。20世纪70年代，国际上已经引入了层析法分离血液制品，进一步提高了生产效率。我国血液制品技术发展较慢，20世纪80年代盐析法才被利用进行人血白蛋白和免疫球蛋白的工业化生产。20世纪90年代，采用低温乙醇法提高产品收率和质量，直至2005年时，国内才慢慢引进层析技术，凝血因子类产品开始大量上市。相比于其他血液制品的发展历程，转铁蛋白发现较晚，20世纪40年代，Holmberg[1]和Schade[17]首次在血浆中发现和分离转铁蛋白。随着低温乙醇法分离血浆蛋白的技术发展，研究者们发现转铁蛋白主要存在于Cohn低温乙醇沉淀法的组分FIV沉淀中。在人血白蛋白的生产工艺中，FIV沉淀一般作为废弃物，所以从FIV沉淀中提取转铁蛋白，既可以提高血浆的综合利用率，又不影响人血白蛋白的生产，后来的研究者更多地采取从FIV沉淀中提取转铁蛋白。

图1 转铁蛋白转运铁作用机制[15]Fig.1 Mechanism of the Fe iron transport by transferrin[15].

3.2 转铁蛋白纯化工艺

转铁蛋白的分离纯化方法包含乙醇沉淀、利凡诺沉淀、硫酸铵沉淀、PEG沉淀和离子交换层析等[18～27]。早期主要使用沉淀法，后来随着层析技术的发展，层析技术逐渐代替沉淀法或与沉淀法共同使用提高纯度及回收率。同时，为了转铁蛋白能够用于临床或者在药品生产过程中作为生化试剂，更多的生产工艺都会加入病毒灭活的步骤，达到安全的效果。表1总结了至今转铁蛋白大规模生产工艺的发展情况，生产工艺从早期的沉淀法演变到后来的层析法，纯度和回收率也有显著提升，并加入病毒灭活步骤，保证安全性。例如，von Bonsdorff 和Parkkinen等利用PEG沉淀、一步阳离子交换层析和一步阴离子交换层析，加入有机溶剂/表面活性剂法(solvent/detergent，简称S/D)病毒灭活和纳滤步骤，得到纯度>98%的转铁蛋白[23,24]。MacCann等[25]以Cohn FII+III上清液为原料，经过两步的阴离子交换层析来纯化得到转铁蛋白。Shabtai[26]以Cohn FIV-1悬浮液为原料，经过PEG沉淀和二步阴离子交换层析，再经过60℃ 10 h病毒灭活，得到转铁蛋白。Ascione等[27]以Cohn FIV-1+FIV-4为原料，经过一步阴离子交换层析和两步病毒灭活，即可得到回收率80%，纯度大于95%的转铁蛋白。

转铁蛋白根据结合铁离子的情况不同，具有不同的形式，因而其生产工艺也有所区别。脱铁转铁蛋白的生产需增加铁去除的步骤，一般可通过降低缓冲液pH和添加螯合剂EDTA来实现。饱和铁转铁蛋白则需要在体系中添加Fe3+。另外，在病毒灭活方面，Haupt[28]指出巴氏灭活并不适于脱铁转铁蛋白的灭活，加入柠檬酸钠或者EDTA作为保护剂后，经过60℃灭活10 h，脱铁转铁蛋白并未发生失活现象。目前，人血浆转铁蛋白尚未有产品上市，只有荷兰Sanquin 血液制品公司的转铁蛋白正在进行临床Ⅰ期实验，用于治疗遗传性转铁蛋白缺乏症，其生产工艺主要包括PEG沉淀、阳离子交换层析和阴离子交换层析，使用S/D处理和纳滤两步病毒灭活及去除步骤，确保制品的安全性。

表1 人转铁蛋白大规模纯化的方法Table 1 Methods of large-scale purification of human transferrin.

4 临床应用进展

转铁蛋白的临床应用主要集中在三个领域：转铁蛋白替代治疗、铁代谢中的铁结合/调节治疗以及药物载体。表2列出了人转铁蛋白的具体临床应用案例。

4.1 替代治疗

转铁蛋白是人血浆中的铁转运蛋白，对于遗传性转铁蛋白缺乏症[clinicaltrials. gov (NCT01797055)]需要输入人血浆转铁蛋白来进行替代治疗[29]。遗传性转铁蛋白缺乏症在全球极为罕见，目前只有少数病例报道，采用血浆纯化的转铁蛋白进行注射治疗，结果血红蛋白和红细胞都有增加，患者身体发展和精神状态都有改善。荷兰Sanquin 血液制品公司的转铁蛋白2010年开始进行临床Ⅰ期实验，用于治疗遗传性转铁蛋白缺乏症。

4.2 铁结合/调节治疗

当体内转铁蛋白处于超载时，体内游离的铁能够催化产生活性氧自由基，而活性氧自由基则会导致机体肾脏、肝脏以及粘膜损伤等。同时，游离铁是细菌和真菌生长所需的元素，游离铁过多会增加致病菌的感染几率。在铁结合及调节治疗领域，转铁蛋白的治疗原理主要基于以上两点，在缺血再灌注损伤[ischemia-reperfusion injury(I/R)损伤]、β-地中海贫血、干细胞移植、化疗等方面有着重要的应用[47]。

表2 人转铁蛋白的临床应用Table 2 Clinical applications of human transferrin.

缺血再灌注损伤(I/R损伤)，是指在组织缺血基础上恢复血流后组织损伤反而加重，甚至发生不可逆性损伤的现象。重新灌注血流会导致较大的氧化压力，非转铁蛋白结合的游离铁会催化产生自由基，这些自由基会导致细胞损伤和紊乱，从而激发I/R损伤，人大脑、心脏、肾脏和肝脏等对I/R损伤非常敏感[30]。科学家们在相关疾病的动物模型上也做了大量的工作。2004年De Vries等[31]首先在肾脏I/R损伤的小鼠模型中，发现脱铁转铁蛋白注入可以有效地减缓肾脏损伤。2009年，Monbaliu等[32]在猪肝脏移植(患有I/R损伤)的模型中注入转铁蛋白发现，移植后原发性移植无功能的发生率高，通过静脉注射转铁蛋白，辅助其他抗炎和保肝药物治疗，能够有效保护受损的肝脏，避免移植后出现肝原发性无功能，促进移植肝功能的修复。2014年，一项临床试验研究将含有脱铁转铁蛋白的联合药物用于减缓肝脏移植后的I/R损伤，目前正处于临床Ⅱ期[clinicaltrials.gov (NCT02251041)]。

β-地中海贫血是由β-球蛋白的基因突变导致β-球蛋白合成减少，从而引起无效血红蛋白的合成以及肝杀菌肽的低表达，导致肠道铁吸收增加和铁超载。在小鼠的β-地中海贫血的模型中发现，通过转铁蛋白的注射，铁代谢紊乱明显改善，稳定了血浆铁离子浓度和血红细胞的存活率，增加了肝杀菌肽表达，红细胞更新速率加快[33～35]。这些结果表明转铁蛋白在小鼠地中海贫血症中起着关键作用，因此，转铁蛋白未来很有希望用于治疗人β-地中海贫血。

干细胞移植和化疗后的病人转铁蛋白水平降低，总血清铁含量降低，非转铁蛋白结合的游离铁含量升高，而游离铁升高与移植后的死亡率有一定的相关[36]，Parkkinen和von Bonsdorff等在此方面做了大量的临床研究[37～39]，这些研究表明，脱铁转铁蛋白在对干细胞移植后铁结合有明显的效果，转铁蛋白水平和总血清铁含量升高，非转铁蛋白结合铁含量降低，可以阻止葡萄球菌的生长，保护机体免受致病菌的感染。同时，临床研究发现，对血管内反复注入大剂量的脱铁转铁蛋白是非常安全的，最大剂量可达115 mg/kg体重。同种异体的干细胞移植会导致肝脏铁累积，导致移植物抗宿主疾病(graft-versus-host disease GVHD)。Bairs等[40]在GVHD的小鼠模型中研究发现，脱铁转铁蛋白的注入可以有效减缓肝脏中的铁累积，阻止肝脏损伤和凋亡。

4.3 药物载体

转铁蛋白受体通常在癌症和肿瘤细胞表面有着高水平的表达，利用转铁蛋白作为药物载体，通过转铁蛋白和转铁蛋白受体的特异性识别，可以将药物靶向地运输到癌细胞和肿瘤细胞表面，进行特异性地杀伤。因此，转铁蛋白的另一个重要临床应用是可作为药物、毒素偶联物、siRNA复合物以及融合体系的靶标分子，进行药物的靶向运输[41～47]。其中有代表的临床案例是白喉毒素(CRM107)与转铁蛋白的偶联药物，用于治疗恶性脑肿瘤，虽然在临床Ⅰ期和Ⅱ期，该偶联药物相比于传统治疗方法展现出更好的抗癌效果，但在临床Ⅲ期由于远远未达到预期效果而停止[41]。另外一个正在进行临床Ⅱ期的案例是转铁蛋白偶联到含抗肿瘤药奥沙利铂脂质体纳米颗粒，用于治疗胃癌[clinicaltrials.gov (NCT00964080)]。这一系列的研究表明转铁蛋白作为药物载体在癌症治疗领域具有非常广泛的应用前景。

5 展望

人血浆转铁蛋白作为体内最主要的铁转运载体，在铁代谢中起着关键作用，对维护机体健康有着重要的意义。临床应用方面，转铁蛋白展现出良好的应用前景。在铁结合治疗领域，相比于小分子铁螯合剂，转铁蛋白作为干细胞移植后的铁结合治疗药物，在预防细菌和真菌感染方面有着无法比拟的优势。在治疗缺血再灌注损伤和β-地中海贫血显现出良好的治疗效果。同时，转铁蛋白可作为药物载体，靶向进行药物的定向输送，在癌症领域展现出越来越广泛的应用前景。在国内血液制品低温乙醇法生产工艺中，人转铁蛋白主要集中在组分FIV沉淀中，而目前国内厂家这部分沉淀直接当废弃物处理，因此，从沉淀中分离纯化出人转铁蛋白，加速新型血液制品人转铁蛋白的开发将具有重大的临床意义和应用前景。