一测多评法测定疏风清热胶囊中五种蒽醌类成分的含量

苏 瑞，于如海

(1.山西中医药大学中药学院，山西 晋中 030619； 2.大同市食品药品检验检测中心，山西 大同 037006)

疏风清热胶囊由蝉蜕、僵蚕、大黄、玄参、薄荷及姜黄6味药材组成，具有疏风清热之效，主要用于外感风热所致的咽喉疼痛等症。大黄作为臣药，味苦性寒，可清热泻火、凉血解毒，而蒽醌类化合物是其发挥药效的有效成分[1-4]。在含量分析中，目前仅对大黄素的含量进行测定，不能体现芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚及大黄素甲醚的含量，从而影响药物的质量控制。一测多评法通过测定同类组分中单一成分，建立与其他成分之间的相对校正因子，从而实现对多个成分含量的控制。该法在解决同时测定多成分成本高、对照品供应不足的问题上有较大优势，已被广泛应用于中药及其制剂的质量控制[5-8]。故本研究采用一测多评法测定疏风清热胶囊中5种蒽醌类成分，为其质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Agilent-1260型高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)；GR-202型电子天平(广州市艾安得仪器有限公司)；DZKW-S-4型电热恒温水浴锅(北京市光明医疗仪器有限公司)；SCQ-5201B型超声波清洗器(上海声彦超声波仪器有限公司)。

1.2 药品与试剂

芦荟大黄素对照品(批号：110795-201609，含量98.1%)、大黄酸对照品(批号：110757-201607，含量99.3%)、大黄素对照品(批号：110756-201502，含量98.7%)、大黄酚对照品(批号：110796-201621，含量99.2%)、大黄素甲醚对照品(批号：110758-201616，含量99.0%)、大黄对照药材(批号：902-9404)均购自中国食品药品检定研究院；10批疏风清热胶囊由同药集团大同制药有限公司提供(批号：01—10)；乙腈为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)；水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液(V∶V=75∶25)，检测波长为254 nm，流速为1.0 ml/min，进样量为10 μl，柱温为35 ℃。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液：精密称取芦荟大黄素0.96 mg、大黄酸1.07 mg、大黄素1.22 mg、大黄酚3.05 mg及大黄素甲醚0.8 mg，置于25 ml容量瓶中，滴加少量三氯甲烷使溶解，加甲醇适量，超声至溶液澄清，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度分别为0.037 7、0.042 5、0.048 2、0.121 0、0.033 8 mg/ml的混合对照品溶液，记为1#。分别精密吸取1#溶液2.5、2.0、1.0、0.5、0.4、0.2 ml分别置于10 ml容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，记为溶液2#—7#，备用。

2.2.2 供试品溶液：取疏风清热胶囊内容物约1 g，精密称定并置于烧瓶中，精密加入甲醇25 ml，称质量，加热回流1 h，放冷后用甲醇补质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10 ml置于锥形瓶中，将溶剂挥干，加8%盐酸溶液10 ml，超声处理2 min使溶解，加三氯甲烷15 ml，回流1 h，快速冷却，置于分液漏斗中，收集三氯甲烷层，水层再用三氯甲烷萃取2次，每次15 ml，收集下层溶液，挥干溶剂，残渣加甲醇溶解，转移至5 ml容量瓶中，定容，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得[9]。

2.2.3 阴性对照溶液：按处方组成比例称取除大黄药材的剩余药材，按制备工艺制成缺大黄的阴性样品，再按“2.2.2”项下方法制备。

2.2.4 对照药材溶液：取大黄对照药材适量，按“2.2.2”项下方法制备。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性试验和专属性考察：取混合对照品溶液1#、供试品溶液与阴性对照溶液，按“2.1”项下条件进样分析，供试品溶液与对照品溶液色谱峰的保留时间相同，且分离度均>1.5，理论塔板数以各色谱峰计均>10 000，阴性对照溶液在相应位置无色谱峰干扰，表明该方法专属性良好，见图1。

A.对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.芦荟大黄素；2.大黄酸；3.大黄素；4.大黄酚；5.大黄素甲醚A.reference substances; B.sample for test; C.negative control； 1.aloe emodin; 2.rhein; 3.emodin; 4.chrysophanol; 5.emodin monomethyl ether图1 疏风清热胶囊的高效液相色谱图Fig 1 HPLC of Shufengqingre capsules

2.3.2 线性关系考察：取混合对照品溶液1#—7#进样测定，以被测成分的峰面积为纵坐标(Y)，进样质量为横坐标(X)进行线性回归，并以信噪比3和10对5种成分进行检测限和定量限考察，结果见表1。

2.3.3 精密度试验：精密量取混合对照品溶液1# 5 ml置于10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，结果显示，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.35%、0.45%、0.38%、0.56%及0.48%，表明仪器的精密度良好。

2.3.4 重复性试验：取样品(批号：03)，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液6份，再按“2.1”项下色谱条件进样分析，结果显示，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚峰面积的RSD分别为1.09%、1.64%、1.52%、0.92%及1.31%，则其平均质量分数分别为0.14、0.47、0.14、0.35及0.07 mg/g，表明方法重复性良好。

表1 5种成分的线性关系考察结果Tab 1 Inspection results of linear relationships of five ingredients

2.3.5 稳定性试验：取同一供试品溶液，在制备后0、2、4、8、12及24 h进样分析，结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.94%、1.44%、1.65%、1.54%及1.51%，表明供试品在24 h内稳定。

2.3.6 加样回收率试验：精密称取已知含量样品(批号：03)9份，每份0.5 g，分为3组，每组3份，分别精密加入含芦荟大黄素0.034 7 mg/ml、大黄酸0.120 9 mg/ml、大黄素0.035 7 mg/ml、大黄酚0.086 5 mg/ml及大黄素甲醚0.019 8 mg/ml的混合对照品溶液1.0、2.0和3.0 ml，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，并计算加样回收率。结果显示，芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚及大黄素甲醚的平均加样回收率分别为99.08%、101.38%、101.84%、97.23%及104.82%，RSD分别为1.65%、1.86%、1.12%、1.26%及1.35%。

2.4 相对校正因子

2.4.1 相对校正因子的测定：取混合对照品溶液1#—7#进样分析，计算待评价成分芦荟大黄素(a)、大黄酸(b)、大黄酚(d)和大黄素甲醚(f)相对于大黄素(c)的相对校正因子，结果见表2。

表2 疏风清热胶囊中5种成分的相对校正因子Tab 2 Relative correction factors (RCF) of five ingredients in Shufengqingre capsules

2.4.2 相对校正因子的耐用性考察：(1)仪器对相对校正因子的影响。采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，考察Agilent1260-1、 Agilent1260-2及岛津2010AHT不同色谱系统对5种成分相对校正因子的影响，结果显示，a、b、d、f与c的相对校正因子的RSD分别为2.62%、2.02%、3.24%和0.92%，均<5%，表明重现性良好。(2)色谱柱对相对校正因子的影响。采用Aglient 1260高效液相色谱系统，考察Thermo ODS-2HYPERSIL、Sepax Bio-C18及Agilent ZORBAX SB-C18不同品牌的色谱柱对5种成分相对校正因子的影响，结果显示，a、b、d、f与c的相对校正因子的RSD分别为0.48%、0.47%、0.40%和0.47%，均<5%，表明重现性良好。

(3)流速对相对校正因子的影响。采用Aglient 1260高效液相色谱系统和 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱，考察0.8、1.0和1.2 ml/min不同流速对5种成分相对校正因子的影响，结果显示，a、b、d、f与c的相对校正因子的RSD分别为0.17%、0.29%、0.18%和1.52%，均<5%，表明重现性良好。(4)柱温对相对校正因子的影响。采用Aglient 1260高效液相色谱系统和Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱，考察30、35和40 ℃不同柱温对5种成分相对校正因子的影响，结果显示，a、b、d、f与c的相对校正因子的RSD分别为0.23%、0.19%、1.94%和0.36%，均<5%，表明重现性良好。

2.4.3 相对校正因子的确定：将不同影响因素所得的结果取平均值，确定芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚4种成分与大黄素的相对校正因子分别为0.67、1.05、0.67和0.69，RSD分别为1.14%、0.74%、1.50%和0.65%。

2.5 待测色谱峰的定位

取同一对照品溶液和大黄对照药材溶液，采用对照提取物法[10]，在不同的仪器及色谱柱的条件下，进样2种溶液，结果显示，大黄对照药材溶液中5个峰均能与对照品吻合，表明对照提取物法定位准确。

2.6 一测多评法和外标法含量测量结果比较

取10批样品，按照“2.2.2”项下方法制成供试品溶液，比较5种成分外标法的测定值与一测多评法计算值，结果显示，2种方法的相对误差均<5%(见表3)，表明一测多评法具有良好的可信度。

表3 疏风清热胶囊中5种成分一测多评法和外标法含量测量结果比较Tab 3 Comparison of the results of content determination of five ingredients in Shufengqingre capsules between QAMS and external reference method

3 讨论

3.1 内参物的选择

由于大黄素的色谱峰保留时间居中，与其他4种成分分离度较高，在药品中含量适中，对照品容易获得，故选大黄素作为内参物[11-12]。

3.2 流动相的选择

梯度洗脱容易出现溶剂峰，保留时间与测定成分的色谱峰相近，极易影响色谱峰的定性和定量分析，故选择等度洗脱，并不断调整甲醇与磷酸比例，最终确定以甲醇-0.4%磷酸(V∶V=75∶25)作为流动相，此时待测色谱峰的分离效果和峰形均较好。

3.3 色谱峰定位

考察了相对保留值法[13-17]及两点校正法[18]在不同仪器和不同色谱柱中的重现性，结果两种方法的RSD在5%～15%之间，重现性较差，可见不同的色谱柱对于大黄蒽醌类成分的选择性差异较大，故根据文献选择大黄对照药材作为随行对照对色谱峰进行定位。

本研究通过测定其他4种成分(芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚)与大黄素的相对校正因子，并对各色谱峰进行定位，最终建立的一测多评法有良好的重现性，可用于疏风清热胶囊中5种蒽醌类成分的含量测定，为该制剂的质量控制提供依据。