基于网络药理学探究人参治疗心肌缺血的作用机制Δ

陈 兴，张 璐，吴诗华，王 涛，高思佳，王 丹，赵艳玲

(1.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137； 2.解放军总医院第五医学中心药学部，北京 100039； 3.浙江中医药大学药学院，浙江 杭州310053)

目前，心血管疾病已成为全球第1位致死、致残的疾病原因，危害甚至超过恶性肿瘤；其中，缺血性心脏病是临床上心血管疾病中较为常见的病理现象，其发病率更呈逐年升高趋势[1-2]。因此，保护缺血心肌一直是心血管领域的研究重点，国内外众多专家学者都在致力于探索预防和治疗此类心血管疾病的有效手段。人参为五加科人参属植物人参PanaxginsengC.A.Mey.的干燥根和根茎，《神农本草经》记载，人参“主补五脏，安精神，止惊悸，除邪气，明目，开心益智”[3]。人参作为最著名的中草药之一，贵为中草药中的“百草之王”，在我国已被广泛应用了几千年，是我国重要的中药宝藏。关于人参的研究和应用一直受到国内外的普遍重视，随着科技不断进步和发展，对人参化学成分及药理作用的研究已取得了重大进展。现代药理研究结果表明，人参在心血管疾病方面具有明确的疗效，能够改善心肌缺血、调控心律失常、抑制血管细胞凋亡和舒张血管等[4-9]。然而，大多数关于人参改善心肌缺血的作用机制研究都是基于离体细胞或动物模型，其对人体的作用机制尚不明确[10-13]。因此，探索人参改善人体心肌缺血的作用机制具有重要的意义。

中药多成分、多靶点的特点导致中药的药效物质基础不清晰，作用基础不明确，甚至很难从整体到组织、器官、细胞和分子水平进行全面系统的中药研究，使得中医药的现代化发展一再遇到困阻。因此，阐明中药的药效物质基础、作用机制是排除中医药现代化发展障碍亟待解决的重大问题[14]。网络药理学在此契机下应运而生，其概念由英国药理学家Hopkins率先提出，是一种基于系统生物学、多向药理学、计算生物学及网络分析等多学科技术和内容的研究手段，运用各种组学、高通量筛选、网络可视化和网络分析等多种技术，建立“药物成分-基因-靶点-通路-疾病”之间的多层次网络关系，从多维度视角考察中药对多种信号通路的调节作用，系统揭示中药核心分子靶点和药效学生物网络，并理解疾病的分子基础，预测药物的药理学作用机制，评估药物的有效性、作用途径及不良反应，从而发现高效低毒的药物，提高临床药物的治疗效果[15]。因此，本研究以网络药理学为研究方法，旨在对人参改善心肌缺血的作用机制进行探讨，以期为人参治疗心血管疾病的临床应用提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 数据的建立

首先在中草药综合数据库(traditional Chinese medicine database @Taiwan，TDT)(http：//tcm.cmu.edu.tw/)中获得人参所含有的活性成分结构，再经中草药活性成分数据库(herbal ingredients’ targets database，HIT)(http：//lifecenter.sgst.cn/hit/)及治疗靶点数据库(therapeutic target database，TTD)(http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)筛选人参活性成分的作用靶点，建立人参性成分靶点数据集。通过人类孟德尔遗传综合数据库(online mendelian inheritance in man，OMIM)(http：//www.omim.org/)筛选出心肌缺血相关基因和蛋白靶点，建立心肌缺血靶点数据集。通过交互蛋白数据库(database of interacting protein，DIP)(http：//dip.doe-mbi.ucla.edu)获得靶点连接蛋白。以上所有靶点均转化成UniProt数据库识别码格式，以便于统一的研究分析。

1.2 活性成分-靶点网络构建

为更合理地阐明人参中活性成分与心肌缺血靶点之间的关系，对其进行网络药理学分析，通过蛋白质-蛋白质相互作用(http：//www.genome.jp/kegg/)分析，将人参的化学成分、成分对应的靶点、心肌缺血对应的靶点和交互蛋白对应的靶点进行整合，构建“成分-靶点-疾病”交互网络，利用Cytoscape 2.8.3软件将以上网络分析图进行可视化，并通过CentiScape 1.2软件对每节点的中介中心性、点度中心性和接近中心性等3个拓扑参数进行分析评估，选择点度中心性2倍中位数的靶点，作为人参改善心肌缺血的目标蛋白靶点。

1.3 基因本体(gene ontology，GO)富集分析

为了说明中药化合物的靶点蛋白在基因功能中的作用，利用Cytoscape 2.8.3软件对蛋白靶点进行GO富集分析，分别从功能、参与的生物途径及细胞中的定位对基因产物进行标准化描述，并绘制GO分析条目图。

1.4 京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析

为了说明中药化合物的靶点蛋白在信号通路中的作用，利用ArrayTrack v.3.5.0软件，将“1.2”项下所得直接作用靶点的UniProt数据库识别码导入其中，进行KEGG通路富集分析，得出交互网络中直接作用靶点分布的相关通路。

2 结果

2.1 “成分-靶点-疾病”交互网络的构建

基于数据库构建方法，共筛选出人参活性成分59个、交互蛋白40个及药物与疾病共同直接作用的蛋白靶点15个，通过网络药理学构建出人参改善心肌缺血作用的交互网络图，采用不同形状图形使其可视化后，可清晰直观地看出药物化学成分与疾病靶点之间的网络关系，见图1。其中，三角形为药物化学活性成分，圆形为交互作用蛋白，正方形为药物化学成分和疾病共同直接作用的蛋白靶标。为了更具特异性地反应出“成分-蛋白-疾病”的之间关系，再以图1中的共同直接作用蛋白靶点为中心，进一步构建网络交互图，见图2。

2.2 人参活性成分及心肌缺血共同直接作用靶点及其拓扑参数

“成分-靶点-疾病“交互网络分析结果显示，药物与疾病共同直接作用的蛋白靶点有15个，其可能是人参改善心肌缺血作用的最相关蛋白靶点，因此，对该15个蛋白靶标进行拓扑参数进行计算，结果见表1。

图1 人参改善心肌缺血作用的“成分-靶点-疾病”交互网络Fig 1 Interactive network of “compound-target-disease” of ginseng in treatment of myocardial ischemia

图2 人参改善心肌缺血作用的“成分-直接作用靶点”交互网络Fig 2 Interactive network of “compound-direct targets” of ginseng in treatment of myocardial ischemia

表1 人参改善心肌缺血作用的“成分-靶点-疾病”交互网络中直接作用靶点的拓扑参数分析Tab 1 Topological parameter analysis of direct targets of interactive network of “compound-target-disease” of ginseng in treatment of myocardial ischemia

2.3 GO分析

对相关蛋白靶点在基因功能中的作用进行研究，共得到GO分析条目24个，见图3。根据人参改善心肌缺血作用预测靶点的GO分析结果，可知相关蛋白涉及的基因功能包括“negative regulation of caleium iontransport”(钙离子运输的负调节)、“negative regulation of extrinsic apoptotic signaling pathway”(外源性凋亡信号通路的负调控)、“active regulation of active oxygen metabolism”(活性氧代谢调节)和“nitric oxide biosynthetic process”(一氧化氮生物合成过程)等方面。

2.4 KEGG通路分析

对网络中所有点的拓扑参数分析结果显示，所有相关蛋白靶标的3个拓扑参数点度中心性、中介中心性和接近中心性的中位数分别为1、0和0.248 394 73。KEGG通路富集分析共富集出43条通路与人参改善心肌缺血的功效相关，主要包括甲状腺激素信号通路、鞘脂信号通路、FcεRI信号通路、血管内皮生长因子信号通路和肿瘤坏死因子信号通路等，见表2。

3 讨论

心肌缺血是指心脏的血液灌注减少，进而导致心脏的供氧不足，心肌能量代谢不正常，难以支持心脏正常工作的一种病理状态。导致心肌缺血因素有很多，除个人饮食、生活习惯、心理、社会和环境等多种外界因素外，冠状动脉阻塞，血压降低、主动脉供血减少，血液黏稠度变化和心肌本身病变等内在因素为导致心肌缺血的直接因素；其中，冠状动脉粥样硬化导致的冠状动脉狭窄或闭塞又为引起心肌缺血最主要、最常见的病因[16-18]。近年来，众多学者对人参在心血管疾病方面的作用进行了大量而深入的研究，发现人参在改善心肌缺血时，可以显著提高氧自由基水平[8]；明显增加冠状动脉血流量和心输出量，增加左心室内压最大上升速率，降低左心室舒张末压、冠状动脉阻力和总外周阻力[9]；改善血流动力学、调节血管功能，刺激血管再生，抑制缺血心肌细胞凋亡[11，19]；还能保护心血管系统，封闭钙离子运动通道，并刺激人体内皮细胞，使其释放更多的一氧化氮，进一步促进血管舒张[4，20-21]。

图3 人参改善心肌缺血作用的GO分析Fig 3 GO analysis of ginseng in treatment of myocardial ischemia

序号通路计数百分比/%P1甲状腺激素信号通路1025.03.20×10-92鞘脂信号通路922.51.00×10-73雌激素信号通路820.04.80×10-74局部粘着1025.05.60×10-75催乳素信号通路717.51.20×10-66神经营养因子信号通路820.01.80×10-67磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B信号通路1127.55.10×10-68细胞凋亡615.01.30×10-59wnt信号通路717.55.70×10-510ErbB信号通路615.06.80×10-511血管内皮生长因子信号通路512.52.30×10-412p53信号通路512.53.40×10-413细胞周期615.03.60×10-414转录因子信号通路615.05.20×10-415促性腺激素信号通路512.51.10×10-316催产素信号通路615.01.10×10-317丝裂原活化蛋白激酶信号通路717.51.60×10-318T细胞受体信号通路512.51.70×10-319胰岛素抵抗512.52.00×10-320FcεRI信号通路410.04.80×10-321泛素介导的蛋白水解512.54.80×10-322B细胞受体信号通路410.05.00×10-323Jak-STAT信号传送途径512.55.90×10-324孕酮介导的卵母细胞成熟410.09.40×10-325蛋白质在内质网中的加工512.51.00×10-226低氧诱导因子-1信号通路410.01.30×10-227趋化因子信号通路512.51.40×10-228Toll样受体信号通路410.01.60×10-229肿瘤坏死因子信号通路410.01.60×10-230环磷酸腺苷信号传导途径512.51.70×10-231多巴胺能突触410.02.60×10-232血小板活化410.02.70×10-233破骨细胞分化410.02.80×10-234核苷酸结合寡聚化结构域样受体信号通路37.53.10×10-235胰岛素信号通路410.03.20×10-236胞吞作用512.54.00×10-237长时程增强作用37.54.40×10-238脂肪细胞因子信号通路37.54.90×10-239环磷酸鸟苷-蛋白激酶G信号通路410.05.10×10-240瞬时受体电位通道的炎症介质调节37.58.80×10-241Rap1信号通路410.08.90×10-242胰高糖素信号通路37.58.90×10-243黑素原生成37.59.10×10-2

本研究通过网络药理学方法，筛选出人参中59个活性、成分40个交互蛋白及15个药物与疾病共同直接作用的蛋白靶点，构建了“成分-靶点-疾病”交互网络图，并对靶点进行GO富集分析和KEGG通路注释分析，明确了相关蛋白靶点的功能类别及参与改善心肌缺血作用的信号通路。GO功能富集分析结果证实，人参改善心血管疾病的基因功能主要体现在钙离子运输的负调节、外源性凋亡信号通路的负调控、活性氧代谢调节和一氧化氮生物合成等过程。在基因的KEGG通路富集中，共筛选得到43条信号通路，其中，与内分泌调节相关的信号通路有甲状腺激素信号通路、丝裂原活化蛋白激酶通路，磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B信号通路，孕酮介导的卵母细胞成熟，促性腺激素信号通路等；与免疫调节相关的信号通路有FcεRI信号通路、T细胞受体信号通路等；与信号转导相关的信号通路有血管内皮生长因子信号通路、转录因子信号通路等；与抑癌相关的信号通路有p53信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等。因此，推测人参中的活性成分可能通过作用于上述信号通路中的关键因子达到改善心肌缺血的目的。

网络药理学为中医药研究的一种新方法，研究思路遵循中医药的整体观，从整体的角度去探索药物与疾病间的关联性，明确中药是一种多成分的协同作用体系，通过作用于不同的蛋白靶标，调控机体的多种生物功能及信号通路，进而发挥整体的治疗机制。本研究借助网络药理学方法，探讨了人参改善心肌缺血的作用机制，明确了中药治疗疾病具有多成分、多靶点、多通路和整合调节作用等特点，同时揭示了人参改善心肌缺血的多维调控网络，为人参用于改善心肌缺血的药物研究提供了依据，为中医药的研究和发展提供了新的思路和方法。