不同倍性虹鳟红细胞规格及血液学指标的比较❋

陈落落， 温海深， 李吉方， 张美昭， 车德钊， 辛苑茹

(海水养殖教育部重点实验室(中国海洋大学)，山东 青岛 266003)

生物体一般为二倍体，在自然或人工诱导条件下，染色体组会成倍地增加产生多倍体，鱼类多倍体现象比较普遍，有相当数量的三倍体、四倍体等天然多倍体鱼类的存在。多数三倍体鱼类不育，可将能量全部用于体细胞生长，从而提高饵料转化率，表现出较好的生长势能。虹鳟(Onchorynchusmykiss)属于鲑形目(Salmoniformes)鲑科(Salmonidae)大马哈鱼属(Onchorynchus)[1]。因其性成熟个体体侧有一条宽而鲜艳的彩虹带而得名，英文名为rainbow trout，原产于北美地区，为典型的冷水性鱼类，是世界性重要经济养殖鱼类之一和水产遗传育种领域的重要研究对象[2]。我国于1959年引进虹鳟，由于长期的近亲繁殖以及缺乏系统的选育，导致养殖个体出现了性早熟、个体小型化、病害频发等问题，不能满足消费者对大规格虹鳟的需求，已成为虹鳟养殖业的瓶颈。因此，进行虹鳟三倍化的诱导成为了解决虹鳟养殖规格问题的关键。

三倍体虹鳟相比于普通二倍体，细胞核内多了一套染色体组，有相关研究表明，三倍体虹鳟红细胞各项数值都高于二倍体[3]。在山女鳟(Oncorhynchusmasou)中也发现了类似的结果，三倍体山女鳟红细胞的长度和宽度分别较二倍体细胞大24%和19%[4]。在团头鲂(Megalobramaamblycephala)中，三倍体红细胞和核体积分别是二倍体的1.40和1.51倍[5]。三倍体虹鳟红细胞由于染色体组的增加，相应地红细胞体积较二倍体大。由此通过观察测量虹鳟红细胞大小可以作为鉴定虹鳟倍性的一种简便、快速、经济的方法。

许多研究表明，鱼类的不同倍性对其各个组织都具有一定的影响。在湖鳟(Salmotruttalacustris)的研究中发现，三倍体湖鳟的肾、鳃、肠、脾等组织结构出现了显著的变化[6]。对其血液学指标也有显著影响，在黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)[7]、鲫(Carassiusauratus)[8]的研究中发现，由于鱼类倍性的增加，血液中红细胞数目、红细胞压积也随之降低，以保证血红蛋白含量维持在一定的水平。鱼类的血液指标始终处于动态平衡中，直接反映了鱼类的内分泌水平和代谢情况[9]。影响鱼类血液生理生化指标的因素大致可以分为内源因子和外部环境因子两类。内源因子与鱼类的遗传生理状况相关，决定了鱼类的血液生理生化特性，并控制着鱼类正常血液生理生化指标的范围[10]。鱼类的多倍性改变了其染色体组成，可能作为一种内源因子改变血液生理生化的指标。本实验采用静水压法诱导虹鳟受精卵获得三倍体，通过流式细胞仪进行倍性鉴定，并对二倍体和三倍体虹鳟的红细胞及其核的大小、部分血液学指标进行测定，比较其差异性，以丰富多倍体鱼类生理学研究内容，并为血液学方法鉴定鱼类多倍体提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用二倍体虹鳟采用常规人工繁殖方法获得，三倍体虹鳟于2016年采用静水压法获得，二、三倍体虹鳟鱼均来源于同一批卵。二、三倍体虹鳟分别饲养于山东省潍坊市临朐玉福淡水渔业合作社，养殖水温为(14±1)℃，pH=7.8。每天早晚各投喂冷水鱼专用配合饲料一次，取样前停食24 h。随机选取15尾健康无伤、1.5龄未知倍性的实验组虹鳟和3尾二倍体虹鳟作对照，通过流式细胞仪测定其相对DNA含量的方法对其进行倍性检测，经鉴定15尾实验组鱼中有2尾为二倍体，其余为三倍体。选取实验组中的2尾二倍体和对照组的3尾共计5尾普通二倍体虹鳟，平均体长(37.3±3.1) cm,平均体重(0.97±0.20) kg，随机挑选5尾三倍体虹鳟，平均体长(34.7±4.8) cm,平均体重(0.84±0.29) kg，抽取血液进行生理生化指标检测。

1.2 实验方法

1.2.1 血样采集 用内壁涂有抗凝剂的注射器从虹鳟尾动脉(或静脉)取血，每尾鱼取1 mL的抗凝血，抗凝剂为15 g/L的EDTA-Na2，抗凝剂与血液的体积比为1∶10，取完血后轻轻摇匀，4 ℃保存，用于血液生理相关指标测定。

不加抗凝剂的血样直接放入普通1.5 mL EP管中，每尾鱼取血3 mL，0～4 ℃静置4～6 h，高速离心机12 000 r/min离心10～15 min后，取上清液，液氮冷冻，置于-80 ℃冰箱冻存，用以测定血液生化指标。

1.2.2 相对DNA含量的检测 采用流式细胞仪(Beckman Coulter FC500M)于波长488 nm下测定实验组和对照组个体的DNA含量。具体方法如下：

①单细胞悬液的制备：将每尾鱼的抗凝血摇匀，使用移液枪分别吸取10 μL血液，加入到1 mL 0.01 mol/L的PBS缓冲溶液中(pH为7.2～7.4)，摇匀，3 000 r/min，离心10 s，洗涤血细胞，倒掉PBS，再加入1mL的PBS，混匀。

②单细胞悬液的固定：使用一次性塑料吸管吸取单细胞悬液，缓慢滴加到3mL预冷的无水乙醇中，4 ℃过夜保存(至少固定3h)。

③染色：将收集到的细胞悬液2 000 r/min离心10 min，弃上清液，PBS洗涤2次,显微镜下将细胞浓度调至1×106个/mL，加入20 μL，50 μg/mL的RNA酶，30 min后再加入20～50 μL，1 g/L的PI染液，置于4 ℃冰箱中染色30 min，使用300目筛绢过滤。

④上机检测，每个样本检测的细胞数目>104个，测量所得的数据和结果由计算机进行处理。

1.2.3 红细胞胞体及红细胞核大小的测量

①将血液样本混匀，吸取10 μL血液置于载玻片上，制作血细胞涂片，自然干燥。

②滴加瑞氏-吉姆萨染液2～3滴覆盖整个标准涂片，染色1～2 min。滴加等量的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(pH为6.4～6.8)，轻轻晃动玻片，与瑞氏-吉姆萨染液充分混匀，染色3～5 min。

③水洗、吸干、镜检。染色后胞浆和胞核的染色清晰分明，细胞核着色呈深浅不同的紫红色，胞浆呈浅红色，胞浆中颗粒区分明显。

④在显微镜下拍照，分别测量红细胞胞体与细胞核的长轴和短轴，每个样本测量10个红细胞，取平均值，根据公式：体积V=a2b/1.91；表面积S=πab/4，式中，a为胞核长轴，b为胞核短轴，计算得到红细胞胞体及其核的体积与表面积。

1.2.4 血液生理指标的测定 血液生理指标白细胞、红细胞及血红蛋白等采用BC-1800全自动血液细胞分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)测定。其原理是用电阻抗法对血细胞进行计数。

1.2.5 血液生化指标的测定 血液生化指标采用BS-1800全自动生化分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)测定，不同指标使用不同的试剂盒测定(迈瑞公司生产)。

1.2.6 血清渗透压的检测 血清渗透压采用蒸汽压渗透压计(Vapro5520)测定，随机选取二倍体和三倍体虹鳟各5尾进行血清渗透压的测定，每尾鱼测定2次，每次使用血清的量为10 μL。

1.3 数据处理

实验数据用平均值±标准差表示，采用SPSS13.0软件进行统计，运用单因素方差分析，先进行方差齐性检验，不满足方差齐性时，对数据进行自然对数或平方根转换，然后采用Duncan 多重比较检验数据差异的显著性，以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 相对DNA含量的检测

使用流式细胞仪测定实验组15尾和对照组3尾虹鳟红细胞的DNA含量，对照组荧光值为310±5(见图1)，三倍体虹鳟为437±13(见图2)，二者比值为1.4，与理论值1.5相近，15尾中有2尾为二倍体。

图1 二倍体虹鳟流式细胞仪检测结果

图2 三倍体虹鳟流式细胞仪检测结果

2.2 二倍体和三倍体虹鳟红细胞大小的比较

如表1所示，三倍体虹鳟红细胞长轴为二倍体的1.25倍，极显著地大于二倍体(P<0.01)，红细胞短轴略大于二倍体，为二倍体的1.20倍，二者差异极显著(P<0.01)，但三倍体虹鳟红细胞长轴与二倍体的比率要大于短轴，所以三倍体红细胞形状与二倍体红细胞存在较为明显的差异，所以在显微镜下观察到的三倍体红细胞更大、更长(见图3)，与三倍体红细胞相比，二倍体红细胞呈现出小而圆的椭球形(见图4)。三倍体虹鳟红细胞体积极显著地大于二倍体(P<0.01)，为二倍体的1.84倍，红细胞面积极显著大于二倍体(P<0.01)，为二倍体的1.49倍。三倍体虹鳟红细胞核明显大于二倍体，三倍体虹鳟红细胞核的长轴、短轴、面积、体积等各项数值分别为二倍体虹鳟的1.42、1.20、1.70、2.39倍，差异极显著(P<0.01)。

表1 二倍体和三倍体虹鳟红细胞及其细胞核大小比较

注：**表示差异极显著(P<0.01)；*表示差异显著(P<0.05),下同。

Note:**denotes extremely significant difference at 0.01 level,*denotes significant difference at 0.05 level，the same below.

①Items；②Triploid；③Diploid；④Long axis of RBC；⑤Short axis of RBC；⑥RBC area；⑦MCV；⑧Long axis of RBC nucleus；⑨Short axis of RBC nucleus；⑩RBC nucleus area；RBC nucleus volume

图3 三倍体虹鳟红细胞(40×10)

图4 二倍体虹鳟红细胞(40×10)

2.3 二倍体和三倍体虹鳟血液生理指标的比较

如表2所示，三倍体虹鳟血液中红细胞数目极显著地少于二倍体(P<0.01)，为二倍体的0.26倍，同样，三倍体虹鳟血液红细胞压积极显著地低于二倍体(P<0.01)，为二倍体的0.28倍。三倍体虹鳟血液中白细胞数目显著地高于二倍体(P<0.05)，为二倍体的1.16倍。而血小板和血红蛋白含量差异不显著(P>0.05)。

表2 二倍体和三倍体虹鳟血液指标

2.4 二倍体和三倍体虹鳟血液生化指标的比较

如表3所示，三倍体血清中碱性磷酸酶、葡萄糖浓度显著低于二倍体(P<0.05)，与二倍体的比值分别为0.61和0.53，三倍体血清中谷氨酸氨基转移酶含量也低于二倍体，但是差异不显著(P>0.05)，白蛋白、总胆固醇、甘油三酯、乳酸脱氢酶、总蛋白含量与二倍体差异不显著(P>0.05)。

表3 二倍体和三倍体虹鳟血液生化指标

2.5 二倍体和三倍体虹鳟血清渗透压的比较

随机选取二倍体和三倍体虹鳟各5尾进行血清渗透压的测定。如图5所示，二倍体虹鳟血清渗透压为(433±9) mOsm/kg，三倍体虹鳟血清渗透压为(433±11) mOsm/kg，二倍体和三倍体虹鳟血清渗透压无显著性差异(P>0.05)。

图5 二倍体和三倍体虹鳟血清渗透压的比较。

3 讨论

3.1 流式细胞术鉴定鱼类的倍性

鉴定多倍体鱼类的方法包括间接法(如核体积测量、蛋白质电泳、生化分析以及形态学检查等)和直接法(如染色体计数以及DNA含量测定等)[11]。流式细胞计数法是一种准确测定细胞核内DNA含量的方法。流式细胞技术作为一种快速高通量的样品分析平台，辅以各种先进检测模块可以衍生出各种新型检测设备，服务于不同领域的需求，其自动化、高通量、多维度等优势越来越受到研究者的重视[12]。流式细胞仪具有快速、准确、用血量少的优点，但对样本的制备具有较高的要求，需要获得分散良好、细胞完整、并且适宜浓度的单细胞悬液。在鱼类的倍性鉴定中，通过鳃、血液、鳍、肝、脾等组织皆可获得单细胞悬液，但血液最为方便且效果最好。对于血细胞样品的制备，红细胞的浓度对结果影响显著，这与流式细胞仪测定原理有关，红细胞用荧光染料染色，这些荧光物质能与细胞核内的DNA进行特异性结合，在激光或紫外光的照射下发射出一定波长的荧光，再用流式细胞仪测出荧光值，因此，荧光值与红细胞和PI染料的比例存在一定的关系，在该实验PI浓度条件下，用来检测倍性的虹鳟血量应当控制在2～10 μL的范围内，浓度过小，测不出荧光值，浓度太大，测得的荧光值偏小，波峰不完整，影响对倍性的准确判断。有研究表明，红细胞甲醛固定法优于红细胞乙醇固定法[13]。本实验研究，两种固定方法都能得到结果，但酒精固定法最佳。鱼类的种群，鱼体大小等因素也有可能影响荧光值。流式细胞仪检测的是细胞核内DNA的相对含量，所以对各个样品的处理条件应当保持一致。该方法的缺点是对样本的质量要求较高，并且样本处理过程繁琐，需要特定的仪器，成本较高。

3.2 二倍体和三倍体虹鳟红细胞大小的比较

一般认为，真核细胞核大小与染色体数目成正比例增加，同时，细胞核与细胞质在细胞中总是维持较稳定的核质比[14]。三倍体虹鳟细胞核内较二倍体多了一套染色体组，因此细胞核较普通二倍体核大，并且细胞本身需要维持一定的核质比例，所以红细胞的体积也较普通二倍体大。已有研究表明，普通二倍体虹鳟红细胞长径平均值约16 μm，短径平均值约9.5 μm[15]，本实验测得的结果为长径16 μm，与记载的数据无明显差异，短径平均值为10.49 μm，略大于有关的报道,可能与不同的虹鳟种群有关。韩英等研究发现三倍体虹鳟红细胞体积与二倍体比值为1.51∶1，细胞核大小与二倍体比值为1.49∶1，与理论值(1.5∶1)比较均无显著差异[16]。本实验研究发现三倍体红细胞与二倍体的比值以及红细胞核与二倍体的比值皆大于理论值1.5，一方面可能是鱼类种群的不同，各指标存在一定的差异，另一方面是年龄的差异，随着鱼体的长大，红细胞也会随之变大，本实验以1.5龄的三倍体、二倍体虹鳟为研究对象，而韩英等所选用的实验鱼为0.5龄，所以本实验所测得的红细胞长轴、短轴、面积、体积及核的各项指标均明显大于其研究结果。本实验通过对有关三倍体虹鳟和二倍体虹鳟红细胞和红细胞核的大小进行比较，发现各项指标均存在显著性差异，并且在相同倍镜下观察到的三倍体与二倍体红细胞在形态和大小上均存在明显的差别，普通二倍体虹鳟红细胞呈小而圆的椭球形，而三倍体红细胞则更大更长，主要是因为三倍体红细胞和细胞核的长轴与二倍体之比分别为1.25、1.42，都分别大于相应的短轴之比，所以在显微镜下感觉像是三倍体红细胞被拉长了。有研究表明，三倍体虹鳟红细胞核的形态存在异常现象，在外周血液中存在19%的具有双核或哑铃型核的红细胞[16]。所以，通过对虹鳟红细胞大小的测量和形态上的观察可以作为一种鉴定虹鳟三倍体与二倍体的方法，该方法具有操作简单、成本较低的优点。不过，也有学者认为这个方法不能准确地反映染色体的倍性。有鉴于此，在使用这个方法之前最好结合流式细胞仪测定方法加以验证。另外，在缺乏其他证据的情况下，这个方法潜在的不准确性使得难以鉴定多倍体与二倍体嵌合体[11]。

3.3 二倍体和三倍体虹鳟血液生理指标比较

影响鱼类血液红细胞数量的因素包括季节变化、健康状况、水温、溶解氧、运动强度、性腺发育的成熟度及饵料质量等，三倍体虹鳟由于红细胞体积的增大，导致红细胞中血红蛋白的增加，从而使得血液中红细胞的数目大为减少，本实验研究对比发现，三倍体虹鳟血液红细胞数目为二倍体的0.26倍，二者差异极显著，红细胞大小和数目两者对血红蛋白的综合影响的结果为三倍体虹鳟血红蛋白含量是二倍体的0.88倍，略低于二倍体，但二者差异不显著，使得血液中的血红蛋白含量维持在一定的水平。Danilo等认为，运动较快的鱼类的红细胞数量、红细胞压积和血红蛋白含量较运动迟缓的种类高[17]。红细胞数量和血红蛋白含量可以反映出生物体对氧气的摄取、运输以及消耗能力，并通过氧气与二氧化碳的交换满足机体生理活动和运动的需要。Holland等的研究表明，体积较小的红细胞具有较大的相对表面积和较短的扩散距离，可加速血红蛋白对氧的吸收和释放，从而具有耐低氧的特性[18]。

白细胞(WBC)作为鱼类机体免疫和体液免疫的重要成分，主要作用是保护机体抵御外部和内部的伤害[19]。本研究中WBC的浓度在三倍体虹鳟中显著高于二倍体，这与三倍体黄颡鱼的白细胞数极显著高于二倍体的结果类似[7]，表明三倍体虹鳟在免疫力、抗病力等方面较二倍体更强，更不易患病。鱼类的抗病力主要依赖于它的免疫功能——特异性免疫和非特异性免疫，吞噬细胞的吞噬作用在这2种免疫中举足轻重[20]。

3.4 二倍体和三倍体虹鳟血液生化指标比较

血浆中的血糖、血脂和血蛋白是指示鱼体新陈代谢的重要指标。血清葡萄糖(GLU)作为直接能源物质可以为机体直接提供能量,GLU的增加既是能量代谢加快的需要也是机体对外界刺激的响应[21]。血糖含量的高低可以直接反映机体的营养状况，三倍体虹鳟血清葡萄糖含量显著低于二倍体，显示三倍体虹鳟体内能量代谢水平低于二倍体，这可能与三倍体虹鳟红细胞体积的增大以及红细胞数目的减少有关，这种变化综合形成的结果为三倍体虹鳟血红蛋白水平较二倍体低，但这种差异并不显著。甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)水平受体内蛋白质和脂质代谢的共同影响，不良的外界环境能引起鱼体增加体内的糖原、脂类和蛋白质的分解来维持体内血糖、血脂及血蛋白的浓度，当三倍体虹鳟处于正常生理代谢状态时，其血清TC和TG与二倍体虹鳟相比并无显著性变化，有利于维持其最基本的代谢水平。

碱性磷酸酶(ALP)是一种在生物界中分布广泛的磷酸酯酶，是生物体的一种重要的代谢调控酶，可以直接参与生物机体磷酸基团的转移、调节机体磷的代谢、维持体内钙磷比例等作用，为ADP磷酸化形成ATP提供所需的无机磷酸[22]。研究发现，三倍体虹鳟血清中碱性磷酸酶的含量显著低于二倍体，碱性磷酸酶活性的降低有利于组织细胞生理活动维持于较低的水平以适应由于红细胞数目的减少带来的携带和输送氧气功能降低的影响。碱性磷酸酶是血细胞溶酶体的特征酶，在血细胞进行吞噬和包裹异物的反应中，伴随着碱性磷酸酶的释放，对异物产生水解破坏作用。鱼类血液中保持有较高活性的碱性磷酸酶对防御外界微生物的入侵具有积极作用[23]。该研究结果显示，三倍体虹鳟血清中碱性磷酸酶含量显著低于二倍体，显示了三倍体虹鳟在非特异性免疫方面的能力可能较二倍体低。总蛋白(TP)具有维持血液正常胶体渗透压，维持pH值恒定的作用，参与脂肪酸、固醇等物质运输并与免疫功能相关；血清白蛋白(ALB)是机体重要的免疫蛋白，与鱼体的抗病及环境适应能力有着密切的关系[21]。三倍体虹鳟血清总蛋白和白蛋白含量与二倍体虹鳟并没有显著性差异，这是维持血液正常渗透压的需要，同时保证机体处于一个相对稳定的内环境状态。血清中谷氨酸氨基转移酶(ALT)活性的相对增加可反映肝功能障碍, 是判断肝细胞坏死的最具特异性的应用指标[24]。经比较发现，三倍体和二倍体虹鳟血清中谷氨酸氨基转移酶(ALT)无显著性差异(P>0.05)。

3.5 二倍体和三倍体虹鳟血清渗透压的比较

血清渗透压代表着硬骨鱼类内部渗透压情况，在外界盐度变化时，起初血清渗透压会随之迅速升高或降低，然后逐渐向初始状态恢复，整个生理过程受渗透压调节机制的影响[25]。本研究的实验鱼养殖在同一淡水水体，没有在三倍体、二倍体之间发现血清渗透压显著差异，表明三倍体虹鳟与二倍体一样具有高效的渗透压、离子调控机制，以维持体内水分及液体的动态平衡。

4 结语

本实验通过流式细胞仪对虹鳟倍性进行了鉴定，在红细胞浓度的选择、红细胞单细胞悬液的固定等方面进行了优化，在此基础上通过比对二倍体和三倍体虹鳟红细胞的大小，发现其红细胞与核体积的比值均要显著大于理论值1.5，这与其他学者的有关研究存在一定差异。通过血液生理指标的测定，三倍体红细胞通过减少数量来降低其体积的增大带来的单个红细胞中血红蛋白含量的增加的影响，这对于其维持机体平衡，保证气体正常运输具有重要意义，但有关三倍体虹鳟在耐低氧方面的能力和机制有待进一步研究。三倍体虹鳟白细胞数量显著高于二倍体，但有关三倍体虹鳟在免疫组织和器官、免疫受体、免疫因子、免疫细胞等方面的应答反应有待进一步研究。