虾青素酯对高脂高糖饮食致小鼠胰岛素抵抗的影响

高 远,杨 鲁,袁诗涵,徐 杰,王玉明,唐庆娟

(中国海洋大学食品科学与工程学院,山东青岛 266003)

由于人们对高脂高糖食物的偏爱,过量摄入导致的胰岛素抵抗、肥胖、高血脂等慢性代谢疾病越来越普遍,严重威胁人类健康[1]。胰岛素抵抗是指组织对循环胰岛素的反应变弱[2],是2型糖尿病、肥胖症、心血管和神经退行性疾病以及几种癌症的主要诱发因素[3]。高脂高糖饮食导致肠上皮细胞紧密连接被破坏,肠道通透性增加[4],来源于肠道菌群的内毒素(LPS)积累增加,穿过肠屏障进入血液后可以引发慢性亚临床炎症过程和肥胖,进而通过激活Toll样受体4(TLR4)导致胰岛素抵抗。循环短链脂肪酸(SCFA)的减少也可能在降低胰岛素敏感性和肥胖的发生中起到重要作用[3]。

虾青素(Astaxanthin)是一种天然的类胡萝卜素,由四个异戊二烯单元以共轭双键形式衔接,在两端有两个异戊二烯单位构成的六元环[5],其结构如图1A所示。虾青素在自然界中广泛分布于虾、蟹、藻等海洋动植物体内,具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎等多种生理活性。已经报道证实,天然虾青素对高脂高糖饮食导致的胰岛素抵抗等代谢综合征具有显著的改善效果[6-8]。在自然界中虾青素主要以虾青素单酯和双酯的形式存在,虾青素酯是虾青素六元环上的羟基与脂肪酸结合产生的,而且脂肪酸链分子组成复杂多样,通常是长链饱和脂肪酸和长链不饱和脂肪酸[9]。虾青素酯的结构如图1B、C所示[5]。

图1 游离态虾青素和虾青素酯的结构Fig.1 Structures of free astaxanthin and astaxanthin esters注:A为游离态虾青素,B为虾青素单酯,C为虾青素双酯。

虾青素酯比游离态虾青素结构更加稳定[10],能够更好地被小肠吸收,并且有更高的生物利用度和组织蓄积量[11-13]。然而,对于单一虾青素酯的作用以及虾青素酯结构和功能之间的关系却鲜有报道。雨生红球藻中的天然虾青素,丁酸虾青素双酯和硬脂酸虾青素双酯并不是虾青素的主要存在形式。本研究选择具有较多活性的短链脂肪酸丁酸和天然虾青素酯中连接脂肪酸最多的硬脂酸合成丁酸虾青素双酯和硬脂酸虾青素双酯,对虾青素酯在缓解高脂高糖饮食致胰岛素抵抗过程中的作用进行探究,旨在探索比天然虾青素活性更好的虾青素产物,为虾青素市场提供新的活力。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验用虾青素酯,包括雨生红球藻来源虾青素酯(虾青素含量38.46%,其余部分为天然植物油),丁酸虾青素双酯(纯度84.18%),硬脂酸虾青素双酯(纯度83.67%) 由中国海洋大学食品科学与工程学院实验室赠送,参照杨鲁等[14]的方法进行制备,化学结构如图2所示;SPF级雄性C57BL/6J小鼠,5～6周龄,体重(20±2) g 购于北京维通利华实验动物技术有限公司,实验动物合格证号为SCXK(京)2016-0011;葡萄糖测定试剂盒 中生北控生物科技股份有限公司;血清胰岛素ELISA试剂盒 武汉华美生物工程有限公司;血清内毒素ELISA试剂盒 苏州卡尔文生物科技有限公司;甲醛、二甲苯、氨水、酒精 国药集团化学试剂有限公司。

图2 实验用虾青素酯的结构Fig.2 Structures of astaxanthin esters used in the study注:A为丁酸虾青素双酯,B为硬脂酸虾青素双酯。

Neofuge 23R型高速冷冻离心机 上海力申科学仪器有限公司;CP224C电子天平 奥豪斯仪器(上海)有限公司;SPARK 10M酶标仪 帝肯(上海)贸易有限公司;石蜡切片机Anglia Scientific，BX41光学显微镜 日本Olympus公司;1260 Infinity高效液相色谱仪 安捷伦科技(中国)有限公司;6890 Series气相色谱仪 安捷伦科技(中国)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物建模和分组 雄性C57BL/6J小鼠暂养一周后根据体重随机分成6组:正常组、模型组、溶剂对照组、藻油来源虾青素酯组、丁酸虾青素双酯组、硬脂酸虾青素双酯组,每组10只。正常对照组喂食低脂低糖饲料(10%能量来源于脂肪,饲料配方同美国Research Diets公司#D12450J),其他组喂食高脂高糖饲料(45%能量来源于脂肪,饲料配方同美国Research Diets公司#D12451)。虾青素酯组分别灌胃溶解在玉米油中的藻油来源虾青素酯、丁酸虾青素双酯和硬脂酸虾青素双酯,灌胃剂量为50 mg/(kg·bw)(以纯的虾青素含量为剂量标准),每天灌胃1次,连续灌胃8周,溶剂对照组灌胃等剂量玉米油,正常组和模型组灌胃等剂量的生理盐水。

实验周期为8周,喂养条件:温度(22±2) ℃,湿度65%±15%。记录实验开始前小鼠的初始体重和结束前小鼠的最终体重,按式(1)计算体重增长率。每周记录1次摄食量,并以8周灌胃实验期间通过食物摄入能量的总和,作为食物累积摄入量。收集小鼠最后一周粪便,-80 ℃保存。

体重增长率(%)=(最终体重-初始体重)×100/初始体重

式(1)

1.2.2 空腹血糖及糖耐量的测定 灌胃实验最后一周的小鼠禁食不禁水10 h(10:00 pm～8:00 am),尾静脉取血,分离血清,根据葡萄糖试剂盒说明书测定空腹血糖浓度。小鼠首次尾静脉取血后立即灌胃2 g/(kg·bw)葡萄糖灌胃液,分别测定灌胃后30、60、90和120 min的血糖值,按式(2)计算血糖浓度—时间曲线下面积(area under the curve,AUC)。

AUC=15A+30B+30C+30D+15E

式(2)

其中:A、B、C、D、E分别代表0、30、60、90、120 min的血糖值。

1.2.3 血清胰岛素含量的测定 灌胃实验结束后小鼠禁食不禁水10 h(10:00 pm～8:00 am),摘眼球取血,分离血清,采用ELISA试剂盒测定胰岛素含量,并按式(3)计算胰岛素抵抗指标HOMA-IR,评价个体胰岛素抵抗程度。

HOMA-IR=(空腹血糖×空腹胰岛素)/22.5

式(3)

1.2.4 小鼠小肠组织切片 灌胃实验结束后小鼠禁食不禁水10 h(10：00 pm～8:00 am),小鼠小肠组织经甲醛固定24 h后,经过脱水、透明、浸蜡和包埋,制作组织切片,切片厚度5 μm。经过脱蜡、苏木精染料染色、氨水反蓝、梯度乙醇脱水处理,伊红染料染色,常规脱水和透明,最后用中性树胶封片。用光学显微镜对小肠组织结构进行观察,每组随机选取5个标本在光学显微镜200 倍视野下拍照,每个标本挑选5根最长并且结构完整的绒毛,使用Image-Pro Plus 6.0软件依次测量绒毛长度(Villus length,从绒毛顶部到肠腺绒毛连接处的直线长短)和隐窝深度(Crypt depth,从肠腺基部到肠腺绒毛连接处的直线长度),对数据进行统计分析,计算小肠绒毛长度/隐窝深度(V/C)比值。

1.2.5 生物可接受率的测定 生物可接受率是指有机会可以被机体利用的量占摄入总量的百分比。小鼠单次灌胃结束后正常进食进水,收集24 h内的小鼠粪便,真空冷冻干燥,研磨并充分混合均匀,然后称取60 mg于10 mL玻璃离心管中,加入3 mL 氯仿/甲醇溶液(2∶1,v/v),涡旋5 min,静置10 min,6000 r/min离心5 min,离心后小心吸取上层有机相,重复提取3 次,合并提取液,氮气吹干,吹干后用1 mL甲醇/MBTE(1∶1,v/v)复溶,经0.22 μm有机膜过滤,置于棕色样品瓶中,于3 d内进行高效液相色谱(HPLC)分析[10],实验过程尽量低温避光操作。

参照Failla等[15-16]学者提出计算生物可接受率(Bioaccessibility)的方法,生物可接受率的计算式(4)如下:

生物可接受率(%)=(灌胃量-排泄量)×100/灌胃量

式(4)

1.2.6 粪便SCFA含量的测定 称取粪便样品0.2 g,加入1200 μL超纯水,振荡1 min,充分混匀。加入浓H2SO4调节pH(2～3),室温下放置5 min,每分钟振荡一次,5000×g离心10 min;收集上清,取500 μL上清加入50 μL稀释100倍的内标二乙基丁酸和500 μL无水乙醚,充分混匀,5000 g离心10 min;取1.0 μL乙醚层用于气相色谱分析[17]。

1.2.7 血清LPS含量的测定 灌胃实验结束后小鼠禁食不禁水10 h(10:00 pm～8:00 am),摘眼球取血,分离血清,采用ELISA试剂盒测定LPS含量。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 虾青素酯对小鼠体重和摄食量的影响

如图3A所示,小鼠喂养8周后,模型组小鼠体重增加量显著(P<0.05),溶剂对照组小鼠体重增加量极显著(P<0.01),分别增加了18.09%和22.13%,如图3B所示,8周的能量摄入总量没有显著性差异。灌胃藻油来源虾青素酯、丁酸虾青素双酯和硬脂酸虾青素双酯8周,体重增长率和能量摄入总量与溶剂对照组没有显著差异。说明虾青素酯对小鼠的体重和能量摄入没有显著影响。

图3 虾青素酯对体重和摄食量的影响Fig.3 Effect of astaxanthin esters on body weight and food intake in insulin-resistant 注:*P<0.05,**P<0.01,与正常对照组相比差异显著;#P<0.05,##P<0.01,与溶剂对照组相比差异显著。图4～图8同、表2同。

2.2 虾青素酯对小鼠葡萄糖耐受性的影响

葡萄糖耐受性与AUC成反比,结果见图4,溶剂对照组小鼠的AUC较正常组极显著升高(P<0.01)。灌胃虾青素酯后,丁酸虾青素双酯组小鼠的空腹血糖水平下降了22.52%,曲线下面积极显著(P<0.01)降低了17.65%,藻油来源虾青素酯和硬脂酸虾青素双酯相比于溶剂对照组有下降趋势,但是没有显著差异。结果显示,溶剂对照组小鼠糖耐量严重受损,且出现了高血糖症状;丁酸虾青素双酯有降血糖作用,效果优于藻油来源虾青素酯和硬脂酸虾青素双酯。

图4 虾青素酯对葡萄糖耐受性的影响Fig.4 Effect of astaxanthin esters on oral glucose tolerance in insulin-resistant 注:A图表示小鼠灌胃葡萄糖后0、30、60、90、120 min的血糖水平;B图表示糖耐实验曲线下面积。

2.3 虾青素酯对小鼠胰岛素抵抗的影响

如图5所示,溶剂对照组小鼠血清胰岛素水平和HOMA-IR极显著(P<0.01)高于正常对照组。灌胃虾青素酯后,丁酸虾青素双酯组小鼠的血清胰岛素水平显著降低了24.61%(P<0.05),HOMA-IR指数极显著降低了46.93%(P<0.01);藻油来源虾青素酯和硬脂酸虾青素双酯对血清胰岛素水平和HOMA-IR指数没有显著影响。结果显示,溶剂对照组小鼠出现高胰岛素血症;丁酸虾青素双酯能够显著降低血清胰岛素水平,极显著改善小鼠的胰岛素抵抗,增强胰岛素的敏感性,效果优于藻油来源虾青素酯和硬脂酸虾青素双酯。

图5 虾青素酯对胰岛素抵抗的影响Fig.5 Effect of astaxanthin esters on insulin resistance in insulin-resistant

2.4 虾青素酯对小鼠小肠组织形态的影响

如图6所示,正常组小鼠肠绒毛排列紧密,结构完整,且长度较长;而模型组和溶剂对照组肠绒毛排列松散,长度变短,显示肠屏障功能被破坏;虾青素酯干预组小鼠小肠组织形态得到改善,绒毛长度有不同程度的增长(图7A),其中丁酸虾青素双酯组比溶剂对照组显著增长25.66%(P<0.05)。模型组和溶剂对照组与正常对照组相比绒毛长度/隐窝深度比值极显著下降(P<0.01)(图7B),藻油来源虾青素酯比溶剂对照组极显著提高42.34%(P<0.01),丁酸虾青素酯显著提高27.28%(P<0.05),对绒毛长度/隐窝深度比值有显著的改善作用。

图6 小肠HE染色图Fig.6 Hematoxilin-eosin(HE)staining of small intestine

图7 虾青素酯对小肠组织结构的影响Fig.7 Effect of astaxanthin esters on histological structure of the small intestine in

2.5 虾青素酯对小鼠血清中LPS的影响

如图8所示,溶剂对照组血清LPS含量极显著(P<0.01)高于正常对照组;灌胃虾青素酯后,丁酸虾青素双酯小鼠血清内毒素含量显著下降了9.68%(P<0.05),藻油来源虾青素酯和硬脂酸虾青素双酯组小鼠血清LPS水平有下降的趋势,但差异不显著。以上结果表明,高脂高糖饲料喂养喂的小鼠肠屏障破坏,细菌释放的内毒素大量入血,机体可能出现慢性炎症;丁酸虾青素双酯可以降低血清LPS水平,效果优于藻油来源虾青素酯和硬脂酸虾青素双酯。

图8 虾青素酯对胰岛素抵抗小鼠血清内毒素水平的影响Fig.8 Effect of astaxanthin esters on serum LPS levels

2.6 虾青素酯对小鼠生物可接受率的影响

由表1可知,三种虾青素酯的生物可接受率在10%～20%之间,三者之间没有显著性差异,该结果与周庆新[18]的结果相似。虾青素酯的低生物可接受率表明,约80%的虾青素通过结肠排出体外,这个过程中有机会与结肠中的肠道菌群接触。据报道,虾青素能够通过调节肠道菌群改善酒精性脂肪肝[19],而丁酸虾青素双酯与肠道菌群之间的作用,有待进一步探究。

表1 虾青素酯的生物可接受率Table 1 Bioaccessibility of astaxanthin

2.7 虾青素酯对小鼠粪便短链脂肪酸的影响

短链脂肪酸能够增加粘蛋白的产生并且影响紧密连接蛋白的表达[20],对肠屏障功能有保护作用[21]。能够激活5′-单磷酸腺苷激活蛋白激酶,改善高脂饮食小鼠胰岛素抵抗和葡萄糖耐受性[22-23]。

由表2可知,高脂高糖饮食导致粪便中短链脂肪酸含量降低,其中模型对照组丙酸含量极显著低于正常组(P<0.01)。和溶剂对照组相比,丁酸虾青素双酯组和硬脂酸虾青素双酯组提高了乙酸、异戊酸含量,但没有显著性差异,其中丁酸虾青素双酯组提高更加明显;丁酸虾青素双酯显著提高了异戊酸含量(P<0.05)。结果显示,丁酸虾青素双酯在一定程度上可以提高粪便短链脂肪酸的含量,显著提高异戊酸的含量。

表2 虾青素酯对小鼠粪便短链脂肪酸含量的影响Table 2 Effect of astaxanthin esters on fecal SCFAs in insulin-resistant

3 结论

本研究采用高脂高糖饲料喂养的方法建立了胰岛素抵抗小鼠模型,研究了虾青素酯对胰岛素抵抗的预防和缓解作用。结果显示,丁酸虾青素双酯能显著降低血清胰岛素含量(P<0.05),改善糖耐量及胰岛素抵抗(P<0.01)。结果表明,连接短链脂肪酸的丁酸虾青素双酯改善胰岛素抵抗的效果明显优于藻油来源虾青素酯和连接长链脂肪酸的硬脂酸虾青素双酯,其作用机制可能与改善肠屏障功能和调节肠道菌群产物LPS和短链脂肪酸相关。该研究为虾青素不同组成成分的活性研究提供理论依据,对虾青素的合成以及虾青素产业的发展有一定的指导意义。