基于主成分和聚类分析的不同乳酸杆菌制备酸浆水品质评价

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(1.湖北文理学院食品科学技术学院,鄂西北传统发酵食品研究所,湖北襄阳 441053; 2.枣阳市食品药品监督管理局,湖北枣阳 441021)

酸浆水作为我国传统的发酵食品之一,因其口感酸甜、生津解乏,并且富含乳酸菌而受到广大消费者的喜爱[1]。酸浆水是使用面粉与烫芹菜为发酵原料,每天用新鲜的面汤勾兑老浆水制作而成[2]。在适宜的条件下,发酵原料经微生物发酵生成以乳酸为主的各种有机酸,从而形成了酸浆水特有的风味[3]。李欣等[4]和Li等[5]研究发现,乳酸杆菌的发酵特性和能力对酸浆水品质有着直接的影响,且乳酸杆菌能发酵碳水化合物,改善蔬菜制品的风味,使营养成分更易吸收[6]。周书楠等[7]和张晓辉等[8]研究发现,酸浆水中的优势细菌是乳杆菌(Lactobacillus),且其相对含量可能高达99.72%。目前,对于酸浆水的研究主要集中在优势菌株的分离[9]、亚硝酸盐[10]、风味成分[11]和发酵工艺[12]等方面,而乳酸杆菌对酸浆水发酵品质的影响研究却相对较少。

电子舌、电子鼻和色度仪常用于发酵蔬菜的滋味[13]、气味[14]和色泽[15]品质评价中,能够排除人为因素的影响,实现各指标的数字化评价。由于其产出数据指标较多,因而将多元统计学方法积极引入到产品品质的区分中显得尤为重要。曾亮等[16]采用主成分和聚类分析对混合采集的不同品种和花期的茶树花的品质进行了分类研究,王玉荣等[17]采用主成分分析对米酒的品质进行了分类研究,有效证明了两类方法在产品品质的区分中应用的可行性。

研究表明,纯种发酵和自然发酵制作的发酵制品的品质存在较大的差异,且纯种发酵更适合于发酵蔬菜类制品的制作[18]。因此本研究采用L.fermentum(发酵乳杆菌)、L.delbrueckii(德式乳杆菌)和L.casei(干酪乳杆菌)进行了酸浆水的制备,使用电子舌、电子鼻和色度仪对酸浆水的感官指标进行了测定,并结合主成分和聚类分析对酸浆水的品质进行了评价和分类研究,以期为酸浆水发酵菌株的筛选和工业化提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

15株L.fermentum:HBUAS53211、HBUAS53212、HBUAS53213、HBUAS53214、HBUAS53218、HBUAS53224、HBUAS53226、HBUAS53227、HBUAS53228、HBUAS53234、HBUAS53235、BUAS53241、HBUAS53244、HBUAS53254和HBUAS53271 均分离自湖北省枣阳市琚湾酸浆面浆水中;15株L.delbrueckii:HBUAS53122、HBUAS53123、HBUAS53125、HBUAS53129、HBUAS53131、HBUAS53133、HBUAS53136、HBUAS53147、HBUAS53156、HBUAS53160、HBUAS53207、HBUAS53154、HBUAS53195、HBUAS53134和HBUAS53146 均分离自湖北省枣阳市琚湾酸浆面浆水中;15株L.casei:HBUAS53301、HBUAS53307、HBUAS53308、HBUAS53309、HBUAS53310、HBUAS53312、HBUAS53315、HBUAS53316、HBUAS53317、HBUAS53319、HBUAS53320、HBUAS53323、HBUAS53329、HBUAS53337和HBUAS53350 均分离自湖北省襄阳市浓香型白酒窖泥中;所有菌株均由湖北文理学院鄂西北传统发酵食品菌种资源库提供;面粉 邢台金沙河面业有限责任公司;芹菜(西芹) 襄阳市609菜市场;食盐 广东省盐业有限公司;内部溶液、阳离子溶液、阴离子溶液、预处理溶液和参比溶液 日本Insent公司。

SA 402B电子舌 日本Insent公司;PEN3电子鼻 德国Airsense公司;Ultra Scan PRO色度仪 美国Hunter Lab公司;SHP-080生化培养箱 上海精宏实验设备有限公司;CR21N高速离心机 日本日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 不同乳杆菌酸浆水样品制作 挑选分离自酸碱水中L.fermentum、L.delbrueckii和L.casei各15 株于5 mL液体MRS试管中活化,再转至150 mL液体MRS三角瓶中扩大培养,待培养结束后,5000 r/min离心5 min,取菌泥溶于30 mL生理盐水制成菌液备用。取纯净水煮沸后冷却至室温,按纯净水质量比例添加0.5%的面粉和1%的芹菜后煮沸1 min,冷却后分装。A1～A15号样品中分别添加100 mLL.fermentum菌液,B1～B15分别添加100 mLL.delbrueckii菌液,C1～C15分别添加100 mLL.casei,并置于37 ℃发酵24 h,8000 r/min离心5 min后备用。

1.2.2 基于电子舌酸浆水滋味品质评价 准确量取40 mL酸浆水和80 mL超纯水混合均匀后8000 r/min离心5 min后上机待测。本研究参考王丹丹等[19]对于腌制大头菜滋味测定的方法,并对样品处理进行适当优化后,对酸浆水的酸、苦、涩、咸和鲜味等基本味,以及涩、苦和鲜味的回味进行数字化测定。

1.2.3 基于电子鼻酸浆水风味品质评价 准确吸取15 mL酸浆水样品与50 mL电子鼻样品瓶中,于50 ℃加热30 min,冷却至室温后平衡15 min后即插入探头进行进样。本研究参考朱娜等[20]对于果实品风味测定的方法并进行适当优化,其进样流量为180 mL/min,清洁时间为90 s,测试时间为60 s。本研究选择49、50和51 s时的响应值为测试数据。

表1 电子鼻标准传感器阵列与性能描述Table 1 Standard sensor arrays and performance specification in electronic nose

1.2.4 基于色度仪酸浆水色泽品质评价 准确量取250 mL备用酸浆水样品进行抽滤,滤液8000 r/min离心5 min后,取上清液150 mL于50 mm×50 mm色度仪专用比色皿中待测。使用白板与黑板对色度仪进行校准后进行酸浆水样品色泽的数字化测定。参考邹金等[21]对于生抽色泽测定的方法,本研究选择的模式为反射模式,每个样品重复测定3次,读数以CIE1976色度空间值L*(暗→亮:0→100),a*(绿→红+),b*(蓝→黄+)表示。

1.3 统计学分析

使用Mann-Whiney test和Kruskal-Wallis test对不同种类乳酸杆菌制备酸浆水品质评价指标之间的差异进行分析;采用主成分分析(principal component analysis,PCA)、典范对应分析(Canonical correspondence analysis,CCA)、聚类分析(Cluster analysis,CA)和多元方差分析(Multivariate analysis of variance,MANOVA)对不同乳酸杆菌发酵制备酸浆水品质差异进行分析。

除主成分分析使用PAST3软件,其他分析均使用MATLAB 2016b软件;所有图均使用Origin 2017软件绘制。

2 结果与讨论

2.1 不同乳酸杆菌发酵对酸浆水品质的影响

2.1.1 不同乳酸杆菌发酵对酸浆水滋味品质的影响 本研究首先使用电子舌技术对45个酸浆水样品的酸、苦、涩、咸和鲜味,以及涩、苦和鲜味的回味进行数字化分析,以不同种乳酸杆菌为分组依据,3组酸浆水的箱型图如图1所示。

由图1可知,同一种乳酸杆菌制备酸浆水的滋味品质差异相对较小,而不同乳酸杆菌制备酸浆水的滋味品质之间差异则较大。经Kruskal-Wallis test发现,3组酸浆水样品的苦、咸、鲜和后味A(涩的回味)的差异极显著(P<0.001),酸和丰度(鲜的回味)的差异非常显著(P<0.01)。经Mann-Whiney test发现,L.delbrueckii制备酸浆水在酸味的强度上显著高于其他两组(P<0.05),在丰度的强度上显著高于L.fermentum制备的酸浆水(P<0.05),而在苦味和咸味的相对强度上显著低于其余两组(P<0.05)。值得注意的是,酸味作为酸浆水重要的特征滋味,在一定强度内,其相对强度越大越能促进人的食欲和解乏,其口感也更佳。因此,L.delbrueckii制备酸浆水的滋味品质整体要优于其他两组。

图1 不同乳酸杆菌制备酸浆水滋味指标的箱型图Fig.1 Box diagram of the taste index of suanjiangshui samples fermented by different kinds of Lactobacillus注:两组之间均采用Mann-Whiney test,含有不同字母的同一指标间差异显著(P<0.05)。

表2 不同乳酸杆菌制备酸浆水色泽指标的差异性分析Table 2 Difference analysis of water color indicators of suanjiangshui samples fermented by different kinds of Lactobacillus

2.1.2 不同乳酸杆菌发酵对酸浆水风味品质的影响 本研究使用电子鼻对酸浆水中的10 组典型物质类型进行测定,以不同乳酸杆菌为分组依据,3 组酸浆水的雷达图如图2所示。由图2可知,不同乳酸杆菌制备酸浆水在W1C(对芳香类物质灵敏)、W5S(对氮氧化物灵敏)、W6S(对氢气有选择性)、W5C(对烷烃、芳香类物质灵敏)、W1S(对甲烷灵敏)和W3S(对烷烃灵敏)风味指标上差异较大,而在W3C(对芳香类物质灵敏)、W1W(对有机硫化物、萜类物质灵敏)、W2S(对乙醇灵敏)和W2W(对有机硫化物灵敏)风味指标上差异较小。由此可见,不同乳酸杆菌制备酸浆水风味品质的差异主要体现在芳香类物质、氮氧化物和烷烃类物质上。经Kruskal-Wallis test发现,W1C、W5S、W5C、W1S和W3S 5个指标在不同乳酸杆菌制备酸浆水之间的差异极显著(P<0.001);经Mann-Whiney test发现,L.fermentum在芳香类物质和烷烃类物质的含量显著高于其他两组(P<0.05),而在氮氧化物和甲烷的含量上显著低于其他两组(P<0.05)。值得注意的是,L.fermentum制备酸浆水的风味和其他两组差异较大,而其他两组的差异相对较小。综上所述,L.fermentum制备酸浆水的风味品质整体上略优于其他两组。

图2 不同乳酸杆菌制备酸浆水风味指标的雷达图Fig.2 Radar diagram of the flavor index of suanjiangshui samples fermented by different kinds of Lactobacillus

2.1.3 不同乳酸杆菌发酵对酸浆水色泽品质的影响 本研究使用色度仪对不同乳杆菌酸浆水的色泽品质进行了评价,其具体强度值如表2所示,3 组酸浆水在L*(明亮度)和a*(红绿度)上差异极显著(P<0.001),在b*(黄蓝度)上差异非常显著(P<0.01)。经Mann-Whiney test发现,L.delbrueckii制备酸浆水在明亮度显著高于L.fermentum(P<0.05),其在黄蓝度上显著高于L.casei(P<0.05)。值得注意的是,酸浆水的明亮度越高,红绿度和黄蓝度的绝对值越接近零,其色泽品质则越优。综上所述,L.delbrueckii制备酸浆水的色泽品质相较于其他两组更优。

2.2 基于主成分和聚类分析不同乳酸杆菌制备酸浆水的差异性分析

2.2.1 基于主成分和UPGMA聚类分析酸浆水的差异性 由电子舌、电子鼻和色度仪测定的多维数据直接用于酸浆水品质的分析较为困难,无法对酸浆水整体的差异性进行分析。本研究首先使用PCA对8个滋味指标、10个风味指标和3个色泽指标进行降维分析。同时,为排除因分组带来的误差,本研究进一步使用有监督的CCA对3组酸浆水样品的空间排序进行进一步分析,并结合CA对PCA和CCA的结果进行进一步的验证。基于PCA分析3组酸浆水样品的3D因子载荷图如图3所示。

由图3可知,总方差贡献率的89.27%来自前3个主成分,其贡献率分别为73.17%、11.43%和4.67%,因此,3个综合变量可以代表绝大部分原始变量的信息,本研究成功地将21个品质评价指标降维到3个不相关的综合变量。由图3亦可知,PC1主要由后味A、W1C、W5S、W6S、W5C、W1S、W3S、L*、a*和b*等10 个指标构成,其中PC1的正影响指标有L*、W6S、W5S、W1S、a*和后味A,明亮度的载荷量最高为0.37,而负影响指标有W1C、W5C、b*和W3S,W3S的载荷量最高为0.37,因此PC1的主要差异集中在烷烃、芳香类物质和明亮度上;PC2的正影响指标为鲜味和咸味,咸味的载荷量最高为0.60,而负影响指标由酸味、涩味和后味B构成,其中酸味的载荷量最高为0.39,即PC2的主要差异集中在酸味和咸味;PC3由苦味、丰度、W1W、W2W、W3C和W2S,且6个指标均为正影响指标,且苦味的载荷量最高为0.44,即PC3的主要差异集中在苦味上。从不同乳酸杆菌发酵分组来看,PC1得分最高的为L.casei,PC2得分最高的为L.delbrueckii,而PC3得分最高的为L.fermentum。

图3 不同种乳酸杆菌制备酸浆水的3D因子载荷图Fig.3 3D factor load diagram of suanjiangshui samples fermented by different kinds of Lactobacillus

由图4a可知,3 组酸浆水样品在空间排布上具有一定的分离趋势,其中L.fermentum发酵的酸浆水样品与其他两组具有明显的分离趋势,而L.delbrueckii发酵的酸浆水尽管有部分与L.casei存在重合,但整体上还是存在一定的分离趋势。本研究进一步使用非加权聚类分析对3 组酸浆水样品进行分析,由图4b可知,当距离大于3.0时,45 个酸浆水样品可分为2 个大的聚类,其中聚类Ⅰ全部由L.fermentum发酵的酸浆水构成,而聚类Ⅱ则由其余两组酸浆水构成;距离为2.5时,45个酸浆水样品可分为2个大的聚类,其中聚类Ⅰ全部由L.fermentum发酵的酸浆水构成,而聚类Ⅱ则包含L.delbrueckii发酵的酸浆水和L.casei发酵的酸浆水。由此可知,聚类分析的结果与PCA的结果一致,进一步说明了PCA结果的正确性。

图4 不同乳酸杆菌制备酸浆水样品因子得分图(a)和聚类分析图(b)Fig.4 Factor score diagram(a)and cluster analysis of suanjiangshui samples fermented by different kinds of Lactobacillus注:A代表L. fermentum制作酸浆水;B代表L. delbrueckii制作酸浆水;C代表L. casei制作酸浆水。

2.2.2 基于典范对应和聚类分析酸浆水整体结构的差异性 本研究为排除分组给分析结果带来的影响,进一步使用有监督的多元统计学方法对3 组酸浆水的空间排布进行分析。以不同乳酸杆菌为分组依据的结果如图5所示。

由图5a可知,3 组酸浆水样品在空间排布上具有明显的分离趋势,L.fermentum发酵的酸浆水样品全部位于X轴原点左侧,L.delbrueckii发酵的酸浆水样品全部位于第四象限,而L.casei发酵的酸浆水则全部位于第一象限。由图5b可知,L.delbrueckii与L.casei发酵的酸浆水之间具有极显著差异(P<0.001),且两者均与L.fermentum发酵的酸浆水具有极显著差异(P<0.001),由此也印证了CCA结果的正确性。聚类分析可根据聚类距离的不同获得不同的聚类结果,而主成分分析结果与聚类距离在2.5时的结果基本相同,说明通过两种方法均能对酸浆水样品进行分类分析。通过这些分析手段可为后续酸浆水发酵菌株的筛选提供一定的参考依据,从而指导酸浆水的工业化生产。

图5 不同乳酸杆菌准备酸浆水样品的典范对应分析图(a)和聚类分析图(b)Fig.5 Canonical correspondence analysis(a)and cluster analysis(b)of suanjiangshui samples fermented by different kinds of Lactobacillus注:***表示差异极显著(P<0.001)。

3 结论

使用电子舌、电子鼻和色度仪对L.fermentum、L.delbrueckii和L.casei制备酸浆水的品质进行了评价,并结合主成分和聚类分析对其差异进行了分析。不同乳杆菌发酵酸浆水样品在空间排布和聚类上具有明显的分离趋势,而同组样品之间则表现出明显的聚类趋势。电子舌结果显示,L.delbrueckii制备的酸浆水在酸味的强度上显著高于其他两组(P<0.05),在丰度的强度上显著高于L.fermentum制备的酸浆水(P<0.05),而在苦味和咸味的相对强度上显著低于其余两组(P<0.05);电子鼻结果表明,L.fermentum在部分芳香类物质的含量上显著高于其他两组;在色泽品质上L.delbrueckii发酵的酸浆水其明亮度较优。综上所述,L.delbrueckii更适合酸浆水的发酵。