基于四级杆/静电场轨道高分辨质谱技术的葡萄酒鉴别研究

宓捷波，王飞，赵孔祥，刘旸，常春艳，郑文杰

（1.天津海关动植物与食品检测中心，天津300461；2.天津师范大学生命科学学院，天津300387）

自20世纪90年代开始，葡萄酒作为一种承载文化和健康养生理念的载体逐渐受到全世界人们的青睐[1]。近年来，我国的葡萄酒消费也呈逐年上升趋势，据海关统计，我国的进口葡萄酒数量几乎以每年50%的速度飞速增长。然而，随着大量葡萄酒的涌入，品牌混乱，价格虚高，原产地造假和品质参差不齐等问题也不断出现[2]。而葡萄酒作为直接饮用的食品，其品质质量必然会直接影响饮用者的健康和体验，因此，如何对葡萄酒进行品质产区鉴别一直是国内外学术界研究的热点[3]。

葡萄酒的鉴别技术目前主要集中于矿质元素[2，4]、稳定同位素[5-8]、香气成分[9-10]和多酚类[11-12]物质的分析。其中，多酚类物质是决定葡萄酒色泽、苦味和收敛性等感官特性的重要物质[13-15]，同时其含量差异也具有品种、工艺和地区的特征，因此，多酚类物质的检测分析对葡萄酒鉴别具有重要的意义。目前，葡萄酒中多酚类物质的检测大多采用液相色谱法（high pressure liquid chromatograph，HPLC）[16-19]和液相色谱质谱法[20-23]，HPLC法灵敏度高、稳定性好，但对于结构相近的多酚类物质定性和区分能力稍差，而液相色谱质谱方法定性区分能力强，应用更为广泛。本研究借助四级杆/静电场轨道高分辨质谱技术建立葡萄酒中13种多酚类物质的检测方法，同时结合多元分析统计技术对来自不同产区国家的54批次葡萄酒的多酚类物质进行检测和分析，通过构建判别分析模型完成了龙胆酸、香草酸、白藜芦醇等关键指标函数的确立，初步实现了葡萄酒品质产区的鉴别，为有效监管和分析葡萄酒产品提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

超高压液相色谱-四极杆/静电场轨道阱质谱仪（配有VIM阀切换和多柱切换模块）：美国Thermofisher公司；Avanti J-30I高速冷冻离心机：美国Beckerman Coulter公司；MS3 basic涡旋混合器、HS 501振荡反应器：美国IKA Weake公司；Xcel VapTM自动氮吹浓缩仪：美国Horizon公司；乙酸乙酯、甲醇、冰乙酸：色谱纯，德国Merck公司；儿茶素、槲皮素二水合物、没食子酸、龙胆酸、对羟基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、阿魏酸、P-香豆素、芥子酸、白藜芦醇等标准品：美国Sigma-Aldrich公司；浓盐酸（36%～38%）：分析纯，利安隆博华（天津）医药化学有限公司；试验一般用水为去离子水。

1.2 样品前处理

取1 mL葡萄酒与9 mL去离子水混合，用浓盐酸调节pH=2，加入3 mL乙酸乙酯，振荡提取10 min，3 500 r/min离心5 min，取上清液至15 mL离心管中，重复提取3次，合并提取液，于30℃水浴中氮吹至干，用10 mL含50%甲醇水溶液复溶。取100 μL复溶液，与900 μL含50%甲醇水溶液混合，过0.22 μm尼龙滤膜后进样检测。

1.3 色谱质谱条件

色谱条件：ACQUITYUPLCBEHC18色谱柱（2.1mm×100 mm，1.7 μm），流速 0.3 mL/min，进样量 10 μL，流动相A为含0.5%乙酸水溶液，流动相B为甲醇，洗脱程序：0～1 min，A 保持 95%，1 min～10 min，A 由 95%变化为10%，10 min～14 min，A保持95%。

质谱条件：采用全扫描（full scan）和目标离子二级扫描（Target MS2）结合方式，负离子模式，全扫描离子范围：100 m/z～500 m/z，分辨率35 000，质量偏差0.000 5%。鞘气流速：0.72 L/min，辅助气流速：3.3L/min，喷雾电压：2.75 kV，毛细管温度：280℃，离子源加热温度：350℃，总碰撞能量（normalized collision energy，NCE）：35 eV。高分辨质谱离子信息及碰撞能量见表1。利用全扫描结果外标法定量，Target MS2结果定性。

表1 13种多酚类物质的HPLC-QE HRMS质谱参数Table 1 Mass spectral parameters of HPLC-QE HRMS for 13 polyphenols

1.4 统计分析

将得到的多酚类物质的数据通过SPSS软件进行数据处理，根据若干因素对待预测对象进行分类，通过分析构建用于定性预报的数学模型，再利用构建模型之外的派生数据进行交叉验证。

首先确立干红-干白，新旧世界通常将欧洲等采用传统技术酿制葡萄酒的产区称为旧世界葡萄酒产区，而美洲、亚洲等采用新技术酿制葡萄酒的产区则被称为新世界产区。欧美亚不同洲别和不同国别4个待预测类别组，利用主成分分析、偏最小二乘法等判别分析方法，以所有13种多酚成分的相对浓度含量为自变量，研究这些化合物相对含量对上述4个待预测类型组的判别能力，从中获得表征类别差异的化合物组；借助差异化学成分构建判别模型，对数据进行模型验证和交叉验证。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

多酚类物质通常是具有带一个或多个羟基的芳环结构，在负离子模式下检测可获得较强的质谱信号[24-25]。依据负离子模式检测时物质离子化的特点，若流动相中含酸会抑制目标物的离子化，所以一般以水为流动相。但以甲醇和水为流动相时，多酚类物质在色谱柱上有严重的拖尾，而加入少量的乙酸后，多酚类物质的峰形有了明显改善。所以为了同时兼顾多酚类物质的峰形和响应值，分别在流动相中添加0.1%、0.2%、0.5%、1.0%的乙酸进行测定，结果表明，含0.5%乙酸的水溶液与甲醇为流动相时多酚类物质的响应最佳。故最终以0.5%乙酸水与甲醇作为多酚类物质的流动相。图1为0.5%乙酸水溶液与甲醇作为流动相时13种多酚类物质的提取离子色谱图，峰形和响应值均可满足分析的需要。

图1 葡萄酒中13种多酚类物质的全扫描提取离子色谱图Fig.1 Full scan chromatograms of 13 polyphenols in wine

2.2 方法学验证

试验结果显示，13种多酚类物质在0.001 mg/L～10 mg/L浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999。以不同水平稀释后分析化合物响应的信噪比（S/N）大于10计算方法的定量下限，得到各物质的定量下限为0.000 5 mg/L～0.002 5mg/L。文献[16-17]研究表明，每升葡萄酒中上述多酚类物质的含量一般为mg级，所以，本方法的灵敏度可以满足葡萄酒中多酚类物质稀释100倍后的检测需要。同时，方法在低、中、高添加水平的加标回收率为78.7%～109.1%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.8%～9.5%。

2.3 多酚指标对干白和干红的判别

采用四级杆/静电场轨道高分辨质谱技术对来自美洲、欧洲、非洲、亚洲和大洋洲的12个国家共54批次的干红和干白葡萄酒进行13种多酚类物质的测定，对所获得的数据以预测“干白-干红”为目标进行分析。表2为各酚酸指标对于“干白-干红”类别组的均值差异情况。

表2 干红、干白的判别分析结果Table 2 Results of squares discriminant analysis based on red wine and white wine

从表2中可以看出没食子酸、儿茶素、龙胆酸和香草酸在不同类型的葡萄酒样品中差异很显著（F值较大），因此在利用这些成分辨别葡萄酒的不同类型（干白或干红）时，它们是重要的参数。

一般而言，判别分析中sig值小于0.05即可判断为显著水平，故本试验中以龙胆酸和香草酸构建进一步的Fisher判别函数。

将原始数据代回上述公式中，实际样品数据的正确率为96.2%。可见，利用该函数模型对干白和干红的类别分析较为有效，与直观的结果分析也十分一致。

2.4 多酚指标对新世界产区和旧世界产区的判别

本试验对所获得的数据以预测“新旧世界产区”为目标进行分析，结果见表3。

表3 新世界、旧世界产区的判别分析结果Table 3 Results of squares discriminant analysis based on new world wine and old world wine

续表3 新世界、旧世界产区的判别分析结果Continue table 3 Results of squares discriminant analysis based on new world wine and old world wine

结果发现这些指标在葡萄酒样品中差异都不显著（Sig值都大于0.05），因此不能够利用这些多酚数据辨别葡萄酒的新旧世界产区。

2.5 多酚指标对洲别的判别

鉴于通常欧洲、美洲、大洋洲和其他洲之间的葡萄酒也会存在工艺、品种上的差异，因此本试验将“洲别”也作为一个预测组，分析结果见表4。

表4 不同洲别产区的判别分析结果Table 4 Results of squares discriminant analysis based on different continents

结果发现龙胆酸和白藜芦醇在不同洲别葡萄酒样品中差异很显著。按2.3所述构建fisher判别函数并借助方程对数据进行交叉验证，对分组葡萄酒样品中的55.3%进行了正确分类。所以，该模型可用于葡萄酒洲产区的初步区分。

2.6 多酚指标对国别的判别

本试验利用同样的判别分析方法以“国家”为预测组进行分析，结果见表5。

表5 不同国家产地的判别分析结果Table 5 Results of squares discriminant analysis based on different countries

结果显示p-香豆素在该预测分类组的葡萄酒样品中差异很显著。按2.3所述构建fisher判别函数并借助方程对数据进行交叉验证。验证结果表明，该模型只能对以国别分组的葡萄酒样品中的27.7%进行正确的国别分类，所以该预测组模型对于国家的区分度相对不高。

3 结论

本研究借助四级杆/静电场轨道高分辨质谱技术建立葡萄酒中13种多酚类物质的检测方法，并利用统计学方法对复杂的数据结果进行类别区分，结果表明，多酚类物质对干白、干红的区分性很好，数学模型的吻合度非常高，对产区洲别的吻合度约50%，基本实现了初步区分的目的。考虑到酒样真实性无法确切保证，上述结果也在预期之内，但利用酚酸类物质进行分析产区的基本模式是可行的，如果在进一步的试验中增加指标参数，再配合真实性可靠的酒样，应该会有更好的结果。