超声波辅助提取玫瑰茄多糖工艺研究

（福建农业职业技术学院，福建福州350003）

植物多糖具有抗血栓、降血糖[1]、增强免疫力[2]、抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗肿瘤[3]、免疫调节[4]等多种生物学功能[5]，因此成为近年来研究热点。植物多糖提取方法主要有超滤法、溶剂提取法、酸提法、碱提法、酶解法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法等[6]。其中超声波辅助提取多糖具有时间短、节约成本[7]、提取速度快、溶剂消耗少、提取效率高、操作简便及对天然产物破坏少等优点[8]，目前广泛应用于天然产物提取[9]。

玫瑰茄（Hibiscus sabdariffa L.），又名洛神花（roselle）、洛神葵、山茄等[10]，是锦葵科木槿属的一年生草本植物[11]。玫瑰茄广泛生长在热带和亚热带地区，在中国广东、广西、云南、福建等有栽培[12]。玫瑰茄花萼可药食两用，含有丰富的维生素C、维生素E、氨基酸、蛋白质、多种矿物质[13]、酚酸类、类黄酮类、花青素等营养物质[14]，具有抗癌、抗高血糖、降血脂、抗炎症、改善消化系统等药理作用[15-16]。玫瑰茄花青素提取研究近年来渐有报道[17]，但未见玫瑰茄多糖相关报道。本文以玫瑰茄干花萼为原料，以玫瑰茄多糖提取率为评价指标，正交试验优化超声波辅助提取玫瑰茄多糖工艺，为玫瑰茄进一步开发利用及工业化生产提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玫瑰茄：市售；D-无水葡萄糖：美国Sigma；浓硫酸、乙醇、苯酚、氯仿：试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DHF-9055A型电热鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；AB204-N型电子天平：上海上平仪器有限公司；Alpha-1502紫外可见分光光度计、HWS-26型电热恒温水浴锅：上海谱元仪器有限公司；LGR10-4.2高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂；As-BDT超声波清洗器：天津奥特塞恩斯仪器有限公司。

1.3 玫瑰茄多糖的测定方法

1.3.1 样品处理

挑选色泽明亮并剔除伤烂病虫花萼的玫瑰茄，用清水洗净玫瑰茄，切开花的底部，顶出果核后在烘箱内60℃烘干12 h，然后进行粉碎。粉碎后密封保存。

1.3.2 玫瑰茄多糖提取工艺流程

玫瑰茄多糖提取采用水浸醇析法提取。将烘干的玫瑰茄粉碎过筛，超声波辅助提取，提取液抽滤除杂，浓缩至原体积1/3，按体积比1∶4加入80%乙醇，冷冻离心10 min，反复多次收集沉淀，得玫瑰茄多糖与蛋白质混合物，沉淀用蒸馏水溶解，活性炭脱色后，用Sevage试剂（正丁醇 ∶氯仿=4∶1，mL/mL），脱蛋白 5次，将上清液定容至100 mL容量瓶中，摇匀得玫瑰茄多糖提取液[18]。

1.3.3 标准曲线的绘制

采用苯酚-硫酸法测定多糖[19]，以葡萄糖作为标准品，精确吸取葡萄糖标准液（0.500 mg/mL）0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 于 7 个 100 mL 容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，摇匀。再分别精确吸取上述溶液2.0 mL于25 mL比色管中，依次加入1.0 mL苯酚溶液（6%），摇匀后加入5.0 mL浓硫酸，迅速摇匀后静置30 min，以蒸馏水为空白，在波长为490 nm处测定吸光度，以葡萄糖标准浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线[20]。

1.3.4 多糖提取率的计算

精确吸取4.0 mL玫瑰茄多糖提取液于100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度，混匀。按葡萄糖标准曲线绘制方法在波长490 nm处测定吸光度[21]。其计算公式为：

式中：C为玫瑰茄多糖质量浓度，mg/mL；N为稀释倍数；V为玫瑰茄多糖提取液定容的体积，mL；M为玫瑰茄干粉质量，g。

1.4 方法

1.4.1 单因素试验

以水为提取液，选择固液比、超声波功率、提取时间和提取温度4个因素，以多糖提取率为衡量标准，进行单因素试验。

1.4.2 正交试验

在单因素试验基础上，确定固液比，超声波功率，提取温度和提取时间为主要影响因素，以玫瑰茄提取率为评价指标，设计L9（34）正交试验优化提取工艺参数，正交试验因素及水平见表1。

表1 正交试验因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design

1.5 数据分析

所有试验均重复3次，结果取平均值，试验数据采用DPS数据处理软件和Excel2016软件进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

葡萄糖标准曲线回归方程y=6.982 1x+0.000 5，R2=0.999 6，式中：x为葡萄糖质量浓度，mg/mL；y为吸光度，见图1。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

结果表明葡萄糖在质量浓度0.00mg/mL～0.06mg/mL范围内与吸光度有良好的线性关系。

2.2 单因素试验

2.2.1 固液比对玫瑰茄多糖提取率的影响

在提取温度40℃、超声波功率210 W、提取时间10 min的条件下，探讨固液比 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）对玫瑰茄多糖提取率的影响见图2。

由图2可知，固液比在 1 ∶10（g/mL）～1 ∶20（g/mL）时，玫瑰茄多糖提取率随着溶液体积增大而增加，在1∶20（g/mL）处达到最大，其后多糖提取率反而下降，总体上低溶液体积提取率高于高溶液体积提取率。其原因是随着溶液体积增大，溶剂用量增加，多糖浸出率随之增大，但当溶剂用量增加到一定值时，超声波辐射被溶剂大量吸收，溶剂溶解杂质也增多，而不能完全作用于样品。因此，选取固液比 1 ∶10、1 ∶15、1∶20（g/mL）进行正交试验。

图2 固液比对玫瑰茄多糖提取率影响Fig.2 The effect of ratio of solid to liquid on extraction efficiency

2.2.2 超声波功率对玫瑰茄多糖提取率的影响

在固液比1∶20（g/mL）、提取温度40℃、提取时间10 min的条件下，探讨超声波功率对玫瑰茄多糖提取率的影响见图3。

图3 超声波功率对玫瑰茄多糖提取率的影响Fig.3 The effect of ultrasonic power extraction efficiency

由图3可知，随着超声波功率的升高，多糖提取率先增加后降低，当超声波功率达到270 W时，提取率最高。其原因是机械作用随着超声波功率增大而增强，分子扩散速度增大，多糖浸出率增大，杂质也增多。因此，选取240、270、300 W进行正交试验。

2.2.3 提取时间对玫瑰茄多糖提取率的影响

在固液比为1∶20（g/mL）、提取温度40℃、超声波功率270 W的条件下，探讨提取时间10、20、30、40、50 min对玫瑰茄多糖提取率的影响见图4。

图4 提取时间对玫瑰茄多糖提取率的影响Fig.4 The effect of extraction time on extraction efficiency

由图4可知，随着提取时间的延长，多糖提取率先升高后下降，以30 min为界点，30 min前提取率随着提取时间延长而升高，30 min后提取率随着提取时间延长而下降，其原因是长时间提取会使多糖分子在空化作用和机械作用下发生降解和破坏，使杂质溶出，导致多糖提取率下降。因此，选取30、40、50 min进行正交试验。

2.2.4 提取温度对玫瑰茄多糖提取率的影响

在固液比为 1∶20（g/mL）、超声波功率 270 W、提取时间 30 min的条件下，探讨提取温度 40、50、60、70、80℃对玫瑰茄多糖提取率的影响见图5。

图5 提取温度对多糖提取率的影响Fig.5 The effect of extraction temperature on extraction efficiency

由图5可知，当温度达60℃时，多糖提取率达到最大值，温度再升高多糖提取率反而下降，其原因是温度升高，分子运动速度加快，多糖容易从细胞中转移到溶质中，但是温度过高，部分多糖化合物容易被氧化破坏，会产生杂质，不利于后续的分离。因此，选取50、60、70℃进行正交试验。

2.3 正交试验

按1.4.2方法来设计L9（34）正交试验，得玫瑰茄多糖最佳提取工艺参数，并考察各因素对玫瑰茄多糖提取率影响的主次顺序。正交试验方案及结果见表2，方差分析见表3。

表2 正交试验方案及结果Table 2 Orthogonal test results of extraction technology

续表2 正交试验方案及结果Continue table 2 Orthogonal test results of extraction technology

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance of orthogonal test

由表2极差分析得出，各因素对玫瑰茄多糖提取率影响主次顺序依次为固液比（A）＞超声波功率（B）＞提取时间（C）＞提取温度（D）。由表3方差分析检验可知，固液比、超声波功率和提取时间达到显著水平（P＜0.05），说明上述三因素对玫瑰茄多糖提取率有显著影响。因此，玫瑰茄多糖提取最佳工艺为：A3B2C1D2，即超声波功率为270 W，固液比1∶20（g/mL），提取温度为60℃，提取时间为30 min。在此条件下，玫瑰茄多糖提取率最高。

2.4 验证试验

由正交试验可知，试验结果最好的方案为A3B2C1D2，而正交表中没有该方案组合，为进一步考察上述提取工艺结果的准确性，按照最优组合A3B2C1D2进行验证试验，平行测定5次，取平均值，测得玫瑰茄多糖平均提取率为56.66%，大于正交试验结果中多糖最高提取率52.91%，相对标准偏差（RSD值为0.47%），表明该方法重复性良好，适合玫瑰茄多糖提取。

2.5 提取次数对玫瑰茄多糖提取率的影响

设超声波功率270 W，提取时间为30 min，固液比为 1 ∶20（g/mL），提取温度为 60 ℃，分别提取 1、2、3次，结果如图6所示。

由图6可知，多糖提取率随提取次数增加而提高，提取3次，提取率最大。但增加提取次数不但多糖提取率变化不大，还会导致大量杂质溶出，为了节约成本，提取次数以2次为宜。

图6 提取次数对玫瑰茄多糖提取率的影响Fig.6 The effect of extraction times on extraction efficiency

3 结论

超声波辅助提取玫瑰茄多糖高效可行，工艺简单，其影响因素主次顺序为固液比＞超声波功率＞提取时间＞提取温度。工艺参数为超声波功率270 W，提取温度 60℃，固液比 1∶20（g/mL），提取时间 30 min，提取2次。在此条件下，玫瑰茄多糖提取率最高，为60.35%。

超声波辅助提取作为一种先进的提取方法，通过超声波对细胞壁产生的破碎效应，从而可以提高了提取成分的效率，是一种高效、快速、环保的提取方法。超声波提取技术应用于玫瑰茄多糖的提取，具有省时、高效、节能、穿透力强、选择性高、有效成分溶出快等特点。更重要的是提取过程避免高温，从而预防因高温对玫瑰茄多糖分子结构的破坏，为玫瑰茄多糖提取实现工业化生产提供了理论依据，对充分利用玫瑰茄资源有现实参考意义。