黑果枸杞叶槲皮素的制备及其体外抗氧化活性研究

段亚云，李建颖，程瑶，白金金

（天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津市食品生物技术重点实验室，天津300134）

黑果枸杞为茄科枸杞属植物，主要生长在荒地、沙漠等较为干旱的地区。其叶可以制茶、降血脂[1]。研究表明，黑果枸杞叶含有多种生物活性成分，随着提取分离技术的不断提高，对黑果枸杞叶化学成分的分析研究也在不断深入，其主要作用有镇静安眠、镇痛抗惊厥、抗氧化等[2]。

特别是对于黑果枸杞叶黄酮类化合物的研究表明，其具有一定的抗氧化活性，是天然抗氧化剂研究的热点。槲皮素（quercetin）是黑果枸杞叶重要的黄酮成分之一，在治疗糖尿病的研究中发现，槲皮素能够抑制实验大鼠肠道中的α-葡萄糖苷酶的活性，从而具有降血糖潜能[3]，但其抗氧化活性的系统研究鲜见报道。本研究采用清除DPPH自由基、ABTS+自由基等5种方法对槲皮素体外抗氧化活性能力作出评价，对其实际的生产应用具有指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑果枸杞叶：甘肃省民勤县；芦丁标准品（纯度：96.6%）：Dr.Ehrenstorfer GmbH；D-101型大孔树脂：南开大学化工厂；0.45 μm微孔滤膜：宁波和平注射器厂；葡聚糖Sephadex LH-20：天津赢达稀贵化学试剂厂；钼酸铵、磷酸钠、1，1-二苯基-2-三硝基肼（DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、磷酸盐缓冲液、过硫酸钾、磷酸氢钠、磷酸二氢钾、氯化硝基四氮唑蓝（nitrotetrazolium blue chloride，NBT）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、吩嗪硫酸甲酯（phenazine methosulfate，PMS）、三氯乙酸 （trichloroacetic acid ，TCA）、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）（均为分析纯）：天津鑫桥化工有限公司。

1.2 仪器与设备

R50型旋转蒸发器：上海申生科技有限公司；DH-101电热鼓风干燥箱：上海精密科学仪器有限公司；UVD-680-1型紫外检测仪：上海金达生化仪器有限公司；5418R型低温冷冻离心机：德国艾本德有限公司；安捷伦1200高效液相色谱仪、G6410B Triple Quad LC/MS美国安捷伦科技有限公司；UV2550型紫外分光光度计：日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 黑果枸杞叶总黄酮的提取

将黑果枸杞叶置于100℃烘箱中杀青30 min，放入60℃烘箱中，烘干至恒重，粉碎后过100目筛，经超声波-微波协同作用，在微波功率176 W，液料比19 ∶1（mL/g），提取时间 9.9 min，乙醇浓度 69%的条件下进行提取。之后进行抽滤，取滤液，经55℃下减压浓缩后，得黑果枸杞叶醇提物[4]。然后加水溶解通过D-101大孔吸附树脂柱，依次采用蒸馏水，3 BV 25%乙醇，3 BV 45%乙醇，6 BV 95%乙醇进行洗脱，收集95%乙醇洗脱液，真空干燥，即得黑果枸杞叶总黄酮。

1.3.2 槲皮素的分离纯化

取一定量总黄酮，用20%甲醇超声溶解，离心并采用0.45 μm微孔滤膜进行过滤，上样于Sephadex LH-20色谱柱，依次用蒸馏水、30%甲醇、60%甲醇和无水甲醇进行洗脱。设定流速为0.5 mL/min，收集馏分，每管10 mL（每1/20保留体积接成一馏分），共洗脱3个柱体积。洗脱完成后，利用高效液相色谱-串联质谱（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS）检测所得流分中黄酮类化合物的纯度，合并相同组成流分。将最终得到的相应黄酮类化合物分别进行浓缩，干燥备用。由此可制备并纯化槲皮素[5]。

1.3.3 槲皮素的结构鉴定

采用HPLC-MS/MS鉴定所得的黑果枸杞叶黄酮类化合物的结构，依据不同成分的色谱特征和质谱特征的不同来鉴定黑果枸杞叶黄酮中的不同成分[6]，并由此确定槲皮素。

1.3.3.1 色谱条件

色谱柱：AgilentPoroshellEC-C18柱（4.6mm×50mm，2.7 μm）；流动相：乙腈-水（含 0.1%甲酸）=50∶50（体积比）；柱温：35℃；进样量：10 μL。

1.3.3.2 质谱条件

电离方式：电喷雾ESI（-）；扫描方式：MS-Scan及Product Ion；电喷雾电压：4 000 V；雾化气体：N2；雾化气压力：35 p.s.i；雾化气流速：10 L/min；离子源温度：350℃；碰撞气体：高纯氮气；碰撞气压力：0.2 MPa。

1.3.4 槲皮素体外抗氧化活性的测定

1.3.4.1 样品溶液的配制

精密称定槲皮素和芦丁粉末，用50%乙醇稀释样品溶液，得到浓度分别为 20、50、100、200、300、400 nmol/L的样品溶液。

1.3.4.2 试剂配制

磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）：精密称取 8.0 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4，溶于800 mL蒸馏水中，充分搅拌至完全溶解，定容至1 L即得pH值为7.4的PBS（0.2 mol/L）。

磷钼试剂：分析天平精密称取2.67 g磷酸钠（Na3PO4·12H2O）于小烧杯中，加入 8.2 mL浓硫酸，充分搅拌至溶解；精密称取1.24 g钼酸铵[（NH4）6Mo7O24·4H2O]，倒入之前小烧杯中，充分搅拌至完全溶解后，将小烧杯中溶液转移至250 mL容量瓶中，并用蒸馏水多次润洗最终定容。磷钼试剂的终浓度为0.6 mol/L浓硫酸，28 mmol/L磷酸钠和4 mmol/L钼酸铵的溶液。现用现配。

DPPH工作液：精密称取3.94 mg DPPH固体粉末，溶于100 mL无水乙醇中，配成DPPH工作液（1.0×10-4mol/L），4℃避光保存。

ABTS 工作液的配制：将 12 mLABTS（7.4 mmol/L）溶液与0.2 mL K2S2O8（2.6 mmol/L）混合，并在黑暗的条件下室温保持12 h后，用pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液稀释40倍～50倍，以在734 nm处获得0.68～0.72的吸光值，4℃避光保存。

NBT溶液：精密称取124 mg NBT固体粉末，用PBS完全溶解至50 mL棕色容量瓶中，定容，得NBT工作液（0.3 mol/L），4℃保存备用。

NADH溶液：精密称取16.6 mg NADH固体粉末，用PBS充分溶解并置于50 mL棕色容量瓶中定容，得NADH工作液（0.468 mol/L），4℃保存备用。

PMS溶液：精密称取0.812 mg PMS固体粉末，用PBS充分溶解并置于50 mL棕色容量瓶中定容，即得0.06 mol/L PMS工作液，4℃保存备用。

卵黄悬液：将卵黄与浓度为0.1 mol/L，pH 7.4的磷酸盐缓冲液配制成1∶1（体积比）悬液，磁力搅拌15 min，再用磷酸盐缓冲液稀释成pH值为1.25的悬液。现用现配。

1.3.4.3 总抗氧化能力

采用磷钼络合物法[7-8]测定槲皮素的总抗氧化活性。取不同浓度的样品溶液0.6 mL于10.0 mL的具塞试管中，加入6.0 mL磷钼试剂，涡旋混匀，于95℃恒温水浴中反应90 min。于695 nm波长下分别测定其吸光度。吸光度值越高表明抗氧化剂的抗氧化能力越强。由此比较槲皮素与芦丁标准品的抗氧化能力。

1.3.4.4 对DPPH自由基的清除作用

参照孙丽萍等[9]方法测定槲皮素清除DPPH自由基的能力。取不同浓度的样品溶液0.1 mL于1.5 mL的离心管中，加入0.9 mL DPPH溶液（0.1 mmol/L），涡旋混匀，闭光反应30 min，于517 nm波长下分别测其吸光度，记作A；用50%乙醇代替样品溶液，测其吸光度，记作A1；用无水乙醇代替DPPH溶液，测其吸光度，记作A0。根据公式（1）计算清除率。

1.3.4.5 对ABTS+自由基的清除作用

参照Payet等[10]和孟庆焕等[11]方法测定槲皮素清除ABTS+自由基的能力。取4 mL的ABTS+工作液于试管中，加入1 mL 95%的乙醇，混合均匀后静置6 min，于734 nm波长下测定吸光度值为A0。将乙醇换成样品溶液用同样的方法测定吸光度为A。根据公式（2）计算清除率。

1.3.4.6 对超氧阴离子自由基的清除作用

取1 mL 50%乙醇于1.5 mL离心管中，作为参比进行空白对照；于1.5 mL离心管中先后加入0.5 mL PBS、0.125 mL NADH、0.125 mL NBT、0.125 mL PMS，取不同浓度样品溶液0.125 mL于离心管中，摇匀后室温下反应5 min，测定其在560 nm处的吸光度值A；用0.125 mL 50%乙醇替换样品溶液，同样的方法测定其在560 nm处的吸光度值A1；向1.5 mL离心管中先后加入0.875 mL PBS、0.125 mL样品溶液，测定其在560 nm处的吸光度值A0。清除率的计算公式见公式（1）。

1.3.4.7 对脂质过氧化体系的抑制作用

参照胡贵丽等[12]方法测定槲皮素对脂质过氧化体系的抑制作用。取0.1 mL卵黄悬液、0.1 mL样品溶液于离心管中，加入0.1 mL FeSO4（25 mmol/L），用磷酸盐缓冲液定容至1.0 mL，在37℃培养箱中培养12 h，取出后加入0.25 mL 20%TCA溶液，静置后离心10 min，取0.4 mL上清液，加入0.2 mL 0.8%TBA溶液，于沸水浴中反应15 min，冷却后，于532 nm波长处测定吸光值A1，参比管为磷酸盐缓冲液，其他步骤相同，测定吸光值A0，根据公式（3）计算样品液对卵黄脂蛋白的脂质过氧化抑制率。

2 结果与分析

2.1 提取物的定性鉴定

槲皮素二级质谱图如图1所示。

由二级质谱图得知：分子离子峰为301.0[M-H]-，表明该化合物相对分子质量为302，近似于槲皮素的相对分子质量。其他离子峰：151.0[M-150]-，120.5，以上离子碎片符合槲皮素的裂解规律。进一步参考相关文献[13]，即可鉴定该化合物为槲皮素。

槲皮素的色谱图如图2所示。

由槲皮素的色谱图得知：出现的色谱峰单一，且峰型、走势良好，呈左右对称，说明该化合物槲皮素成分单一，且纯度较高。

2.2 体外抗氧化活性的评价

2.2.1 总抗氧化能力

依据吸光度所得的槲皮素总抗氧化能力，以芦丁标准品作为阳性对照，研究槲皮素的抗氧化活性。测定结果如图3所示。

由图3可知，芦丁标准品有较好的抗氧化能力，而槲皮素在20 nmol/L～300 nmol/L时表现出抗氧化能力的不稳定性，但随着浓度的升高，抗氧化性逐渐增强，且趋于稳定。在浓度为50 nmol/L～400 nmol/L范围内，芦丁标准品的总抗氧化能力高于槲皮素的总抗氧化能力。

图1 槲皮素质谱图Fig.1 The mass spectrogram of quercetin

图2 槲皮素色谱图Fig.2 The chromatogram of quercetin

图3 总抗氧化能力Fig.3 The total antioxidant capacity

2.2.2 对DPPH自由基的清除作用

依据公式（1）所得的槲皮素对DPPH自由基的清除率，以芦丁标准品作为阳性对照，研究槲皮素的清除能力并探究其抗氧化活性，测定结果如图4所示。

图4 对DPPH自由基的清除能力Fig.4 The scavenging activity on DPPH free radical

由图4可知，在20 nmol/L～400 nmol/L范围内，随着浓度的增加，两者清除DPPH自由基的能力明显提高，且槲皮素的清除率与浓度量效关系十分明显。溶液浓度为400nmol/L时，芦丁标准品清除率高达87.86%，槲皮素的清除率也大于35.04%。但总体来说，在此浓度范围内二者清除DPPH自由基的能力有一定差距。

2.2.3 对ABTS+自由基的清除作用

依据公式（2）所得的槲皮素对ABTS+自由基的清除率，以芦丁标准品作为阳性对照，研究比较槲皮素的清除能力并探究其抗氧化活性，测定结果如图5所示。

图5 对ABTS+自由基的清除能力Fig.5 The scavenging activity on ABTS+free radical

由图5可知，槲皮素和芦丁标准品对ABTS+自由基均表现出不同程度的清除活性。二者均随其浓度的增加，清除率也随之增大，特别是槲皮素，浓度与清除率呈明显的量效关系，溶液浓度为400 nmol/L时，芦丁标准品清除率高达96.8%以上；槲皮素的清除率也大于68.0%。

2.2.4 对超氧阴离子自由基的清除作用

依据公式（1）所得的槲皮素对超氧阴离子的清除率，以芦丁标准品作为阳性对照，研究比较槲皮素的清除能力并探究其抗氧化活性，测定结果如图6所示。

图6 对超氧阴离子自由基的清除能力Fig.6 The scavenging activity on the super-oxide anion free radical

由图6可知，在50 nmol/L～400 nmol/L浓度范围内，随着槲皮素和芦丁标准品浓度的增大，对超氧阴离子自由基的清除率逐渐增强；浓度低于40 nmol/L时槲皮素对超氧阴离子的清除能力高于芦丁标准品对超氧阴离子的清除能力，当浓度高于40 nmol/L时，结果相反，芦丁对照品在浓度400 nmol/L下，清除超氧阴离子的能力高于46.0%，槲皮素对超氧阴离子的清除能力达35.1%，在试验浓度的条件下，二者的清除能力还是有一定的差距，但随着浓度的增加，槲皮素的清除能力升高更加明显，有较好的量效关系。

2.2.5 对脂质过氧化体系的抑制作用

依据公式（3）所得的槲皮素对脂质过氧化体系的抑制率，以芦丁标准品作为阳性对照，研究比较槲皮素的清除能力并探究其抗氧化活性，测定结果如图7所示。

图7 对脂质过氧化的抑制能力Fig.7 The inhibiting activity on the lipid peroxidation

由图7可知，在试验浓度范围内，随着槲皮素和芦丁标准品浓度的增大，其脂质过氧化抑制率逐渐增强；槲皮素的脂质过氧化抑制率与浓度具有良好的线性关系；当浓度低于50 nmol/L时，槲皮素的脂质过氧化抑制率高于芦丁标准品，在400 nmol/L浓度下，槲皮素脂质过氧化抑制率为27.7%。当浓度在50 nmol/L～400 nmol/L时，芦丁标准品的脂质过氧化抑制率高于槲皮素。

3 结论

采用超声波-微波提取、大孔吸附树脂以及Sephadex LH-20等方法制备槲皮素。并采用HPLCMS/MS鉴别所得化合物为槲皮素。通过考察槲皮素的总抗氧化活性，清除DPPH自由基、ABTS+自由基、超氧阴离子自由基以及脂质过氧化体系中脂质过氧化抑制率5个指标，由此评价槲皮素的体外抗氧化活性。研究结果表明，槲皮素具有一定的抗氧化活性，相同浓度下，槲皮素清除3种自由基的能力表现为：清除ABTS+自由基能力最强，浓度在300 nmol/L～400 nmol/L时清除率达68.0%。清除DPPH自由基能力和清除超氧阴离子自由基能力基本持平，浓度在300 nmol/L～400 nmol/L，对DPPH自由基和超氧阴离子自由基的清除率为35.1%。400 nmol/L浓度下，槲皮素脂质过氧化抑制率为27.7%。初步可得槲皮素具有一定的抗氧化活性，且有良好的量效关系。