流感病毒生命周期研究进展

朱艳慧，王升启,2

1.天津中医药大学，天津 301617；2.军事医学研究院 辐射医学研究所，北京 100850

流行性感冒又称流感，是由流感病毒引起的急性呼吸道疾病。流感可分为季节性流感和大流行性流感。季节性流感每年都有发生，而且流感种类非常多，需要对正在传播的病毒株进行密切监视，并针对预测的病毒株每年提供更新的疫苗接种。大流行流感是一种高致病性流感，每隔一段时间就会发生一次，病毒株会在人群中迅速传播，导致发病率和致死率急剧上升，带来巨大的经济和社会负担[1-3]。如1918～1920年H1N1亚型“西班牙流感”、1957～1958年H2N2亚型“亚洲流感”、1968～1969年 H3N2亚型“亚洲流感”、1977～1978年H1N1亚型“香港流感”、2009年首先在墨西哥暴发的H1N1亚型流感[4]、2013年首先在中国报道的H7N9亚型流感[5]。据世界卫生组织报道,每年有290 000～650 000死亡人数与流感引起的呼吸道疾病有关，造成了巨大的疾病负担[6]。

1 流感病毒生物学简介

流感病毒是正粘病毒科（Orthomyxoviridae）的分节状单链负义RNA病毒，病毒颗粒通常为球形，直径80～120 nm，也有丝状的长约几微米[7]。流感病毒可以借助空气迅速传播，引起呼吸道感染，导致免疫缺陷的感染者患上严重的并发症，如肺炎或急性呼吸衰竭等。根据病毒基质蛋白1（matrix 1，M1）和核蛋白（nucleoprotein，NP）的抗原性不同，可将流感病毒分为A（influenza A virus，IAV）、B（influenza B virus，IBV）、C（influenza C virus，ICV）和 D 型（influenza D virus，IDV）。IAV、IBV和ICV可以感染和引起人类呼吸道疾病；IDV主要感染牛，目前还不知道是否可以感染人类。IAV还能够感染多种动物，如鸟、猪、马、海洋哺乳动物和其他宿主，引起大流行，根据其表面血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）的分子特征不同又可分为不同亚型，迄今鉴定了18种HA亚型（H1～H18）和11种NA亚型（N1～N11）[8-9]。IAV的基因组包括8个独立RNA片段，编码至少12种功能明确的蛋白。NS片段编码宿主抗病毒反应拮抗剂NS1（nonstructural protein 1）和核输出蛋白NS2（也称为NEP），M片段编码基质蛋白M1和离子通道蛋白M2，此外还有受体结合蛋白血凝素HA，唾液酸破坏酶神经氨酸酶NA，核蛋白NP，聚合酶蛋白PA、PB1和PB2。PB1片段还编码N40蛋白和促凋亡蛋白PB1-F2，后者在病毒致病性方面发挥关键作用[10]。3种膜蛋白HA、NA和M2组成IAV的脂质双层膜，脂膜下是M1基质蛋白。病毒内部的8个单链RNA被包裹在病毒核糖核蛋白复合物（viral ribonucleoprotein complexes，vRNP）中，vRNP的蛋白质成分由核蛋白NP和聚合酶蛋白PA、PB1、PB2 组成[11]。

2 流感病毒复制的生命周期

流感病毒复制的生命周期涉及多个步骤：①病毒通过唾液酸受体黏附于细胞表面；②病毒通过受体介导的内吞作用发生内化；③病毒包膜与核内体膜融合；④病毒基因组vRNA从病毒粒子脱壳并进入细胞质；⑤在核定位信号（nuclear localization signals，NLS）帮助下，vRNA 进入细胞核；⑥互补RNA（complementary RNA，cRNA）的合成和病毒基因组vRNA的复制；⑦以进入细胞核的vRNA为模板合成mRNA；⑧包膜蛋白（HA和NA）的合成和糖基化；⑨其他蛋白的合成；⑩病毒包膜蛋白插入细胞膜子代病毒粒子的组装和出芽病毒粒子的释放[12]。

2.1 吸附

流感病毒与呼吸道上皮细胞的唾液酸受体特定结合。不同物种的上皮细胞表达不同的唾液酸受体，甲型流感病毒株识别不同类型的唾液酸受体，这使得人畜共患病传播困难。人流感病毒株识别人类肺和上呼吸道上皮细胞唾液酸α-2，6半乳糖受体，动物流感病毒株识别鸟类和猪的上皮细胞唾液酸α-2，3半乳糖受体。但人类下呼吸道也可以表达唾液酸α-2，3半乳糖受体，允许高致病禽流感病毒（highly pathogenic avian influenza，HPAI）感染肺泡巨噬细胞，使得H5N1在人类中广泛传播导致原发性肺炎的发生。流感病毒HA介导与唾液酸受体的结合。HA是三聚体分子，HA1是宿主细胞受体结合的关键位点，而HA2是体内融合的关键位点。流感病毒HA蛋白形成膜远端口袋作为结合位点，其中190螺旋（残基 190～198）、130环（残基 135～138）和 220环（残基221～228）形成口袋的三面，保守残基Tyr98、Trp153、His183和Tyr195位于口袋底部，构成口袋的氨基酸残基通过氢键和范德华力与唾液酸受体相互作用。另外，第二个受体结合位点位于HA1和HA2之间，只有唾液酸α-2，3半乳糖受体具有较弱的结合亲和力，唾液酸α-2，6半乳糖受体不能结合到这个位点[13]。

2.2 内吞

流感病毒可通过网格蛋白介导的以及网格蛋白和小窝蛋白非依赖的内吞途径感染细胞[14]。细胞内吞包括吞噬作用和胞饮作用。吞噬作用通常是指特定细胞消化大颗粒和细菌，如巨噬细胞；胞饮作用是指负责细胞对液体、大分子和病毒等小病原体的吸收。胞饮作用涉及几个不同的机制：巨胞饮、网格蛋白介导的内吞作用、小窝蛋白介导的内吞作用，以及不依赖网格蛋白和小窝蛋白的通路。网格蛋白介导的内吞作用是依赖受体和结合配体的浓度进入网格蛋白包裹的囊泡（clathrin-coated pits，CCP）发生的。这些囊泡离开质膜后与其他内吞囊泡或核内体发生融合。对于网格蛋白介导的内吞作用，涉及2条可能的途径：①配体和结合受体靶向细胞表面已经存在的CCP，此过程需要G蛋白偶联受体参与；②结合配体招募网格蛋白和辅助因子形成新的CCP。通过网格蛋白介导途径进入的流感病毒颗粒，有94%都是在病毒结合位点形成新的CCP发生内吞作用[15]。

2.3 融合

流感病毒被内吞后，首先经历第一个酸化步骤早期核内体（pH6），然后被运输至晚期核内体（pH5），酸化环境触发融合，并将基因组运输至细胞质中[16]。在流感病毒感染过程发挥重要作用的核内体是由Rab蛋白和其他因子调控的。在早期核内体中，内化的物质被运输到不同目的地：回收的配体和受体被返回到细胞表面，而降解的物质被运输到溶酶体。Rab5参与早期核内体运输，Rab11或Rab4调控运输需要返回到细胞表面的配体和受体，Rab7和Rab9调控运输到溶酶体和晚期核内体[17-18]。流感病毒融合依赖HA的几个特性，这些特性是在病毒脱壳之前的复制周期中启动的。在流感病毒粒子中，HA分子具有高度的α螺旋二级结构，处于亚稳态，疏水融合肽隐藏在分子底部。病毒粒子进入核内体后，其低pH环境触发病毒包膜与核内体膜的融合，并启动融合事件：HA前体多肽（HA precursor polypeptide，HA0）构象变化和M2离子通道打开。由于pH诱导HA0构象改变，将埋藏的HA2融合肽挤压到HA分子的远端。新形成的HA2 N端融合肽进入HA三聚体分子内部，与离子化的残基连接，形成具有融合能力的中性pH结构。融合肽插入核内体膜导致两膜合并。当插入的HA2的两端靠近时，两膜发生融合，形成明显的半融合中间体，然后形成融合孔。病毒核的酸化有助于vRNP从核内体通过融合孔释放到细胞质中[19]。总之，流感病毒HA介导病毒膜与核内体膜的融合过程：首先，HA被N端裂解至融合肽，从HA0到HA1和HA2的裂解对于在核内体发生的随后的构象变化和允许融合肽暴露至关重要；其次，在融合过程中三聚体协同工作；第三，在出芽过程中，HA被分割成脂质微区，有助于后续的融合活性[20]。另外，流感病毒的包膜含有高水平的胆固醇，胆固醇的消耗严重影响病毒粒子感染细胞的能力。这种消耗可能直接影响病毒融合或病毒复制中的其他早期事件[21]。

2.4 脱壳和进入细胞核

流感病毒脱壳和进入细胞核在病毒生命周期中是必不可少的。病毒感染后30～90 min，大约30%的IAV颗粒在“周围核”区域与晚期核内体融合脱壳。抑制病毒M2离子通道和核内体酸化可防止IAV脱壳。流感vRNP通过病毒HA分子和M2离子通道的协同作用从核内体释放。HA介导的病毒膜与核内体膜融合后提供一条通道，与M1基质蛋白分离的vRNP可以通过该通道进入细胞质。M2通过酸化病毒粒子内部环境介导M1与vRNP的分离[22]。细胞质中的vRNP通过经典的α/β1输入蛋白依赖性核导入途径进入细胞核[23]。但秦冲等[24]报道，流感病毒脱壳后，vRNP分别释放到细胞质中，单个的vRNP经历3个阶段的主动核导入过程，并在细胞核内呈现2种扩散模式。第一阶段，vRNP 以0.34±0.07 μm/s的平均速度从“周围核”区域移动到细胞核边界；第二阶段，vRNP通过振动运动与核膜结合并穿过核膜，整个过程持续33～89 s；第三阶段，在细胞核内，vRNP进行快速和单向运动，以0.2～1.1 μm/s的瞬时速度历经几秒钟到达核位点。但是，并非所有vRNP都能进入细胞核，完成转录和复制。

2.5 转录和复制

流感病毒在细胞核中进行转录和复制。流感病毒RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）是由PA、PB1和PB2亚基组成的异三聚体，以病毒RNA（vRNA）为模板，在转录过程中合成细胞核中有帽状、多聚腺苷酸化的mRNA，在复制过程中合成模板RNA（cRNA）和vRNA。以宿主pre-mRNA的5′帽子RNA片段为引物启动转录，RdRp合成mRNA的启动子分别位于vRNA的5′和3′末端，是分别由13和12个保守核苷酸组成的部分双链螺旋RNA结构[25]。PB1亚基行使RNA聚合酶功能；PB2亚基结合细胞premRNA的5′帽子结构，形成有帽子的病毒mRNA；PA上的N端结构域切割5′帽子结构下游的10～13个核苷酸，产生带帽子的RNA引物。然后将引物转移到PB1亚基上的聚合酶活性位点，PB1将其作为引物，以病毒基因组作为模板合成帽状mRNA，最后mRNA被多聚腺苷酸化[26-27]。vRNA的复制分2个阶段，首先形成vRNA的cRNA，然后复制该cRNA产生vRNA。在此过程中，NP通过RNA结合和病毒聚合酶结合依赖性机制参与病毒基因组的复制。另外，NP是一种单泛素化蛋白，在体内可被USP11去泛素化。USP11的去泛素酶活性可以抑制流感病毒vRNA和cRNA的复制[28]。NP的泛素化位点为K184，K184突变NP可以抑制病毒基因组的复制[29]。

2.6 组装和出芽

流感病毒颗粒的组装、出芽和释放是病毒生命周期的最后，关系着病毒的存活和致病能力。流感病毒的组装和出芽需要几个必不可少的步骤：①将所有病毒（亚病毒）成分带到组装位点，即非极化细胞的质膜或者极化上皮细胞的顶端质膜；②所有病毒成分必须有序地相互作用，才能组装成具有传染性的病毒粒子；③在组装位点亚病毒成分相互作用使质膜向外弯曲启动芽胞的形成；④在芽柄上附着的膜必须融合，使病毒颗粒从宿主细胞分离并释放到细胞外环境中[30]。流感病毒都是在受感染的极化上皮细胞的顶端质膜组装和出芽的。由于vRNP是在细胞核内合成的，因此必须先将vRNP从细胞核运输到细胞质中，然后再转运到极化上皮细胞的顶端质膜。M1是一种具有核定位信号的蛋白质，可以进入细胞核，与vRNP和NEP相互作用，形成一个（Crm1-RanGTP）-NEP-M1-vRNP“菊花链”复合物被运输到细胞质中[31-32]。另外，病毒包膜蛋白（HA、NA和M2）也被运输到病毒感染细胞的顶端质膜，在质膜上以离散的斑块进行聚集组装。病毒糖蛋白HA和NA参与出芽位点的选择。Scheiffele等[33]对纯化的流感病毒颗粒进行生化分析发现，HA和NA与具有脂质筏溶解特性的质膜相结合，流感病毒的出芽就发生在脂质筏结构上。形成的流感病毒颗粒通过膜分裂从细胞中释放，NA裂解细胞表面唾液酸受体使病毒离开感染的细胞，释放的流感病毒继续感染其他细胞，至此流感病毒完成了一个完整的生命周期。被流感病毒感染的细胞发生死亡，死亡机制多种多样，包括蛋白合成中断和细胞凋亡等。由于病毒在细胞死亡前持续释放数小时，许多呼吸道上皮细胞受到影响并在几个复制周期内死亡。

总之，禽流感病毒和人流感病毒分别与细胞表面唾液酸α-2，3或α-2，6半乳糖受体结合，然后流感病毒以细胞骨架依赖的方式通过网格蛋白介导或网格蛋白和小窝蛋白非依赖的方式进行内吞。病毒粒子通过Rab5和Rab7阳性的早期和晚期核内体进行运输，在低pH环境下，HA介导病毒膜与晚期核内体膜融合脱壳，释放到细胞质中的不同vRNP片段分开进入细胞核，完成转录和复制，然后所有亚病毒成分在质膜完成组装和出芽，最后释放到周围环境中。

最近感染高致病性禽流感病毒H5N1和H7N9病例的增加，引发了人们对流感病毒大流行潜力的担忧。对流感病毒的生命周期进行综述，有助于更好地理解流感病毒的致病机制，为更全面开发药物的作用靶点提供参考。