非洲猪瘟研究进展

郗永义，林艳丽，王友亮

军事医学研究院 生物工程研究所，北京 100071

非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASF virus，ASFV）感染家猪或野猪引发的一种急性、烈性传染病，蜱是ASFV的自然宿主和传播媒介。感染后症状一般表现为全身出血、呼吸障碍和神经症状等，病程时间短，病死率高，最急性和急性型感染死亡率高达100%。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病，也是我国重点防范的一类动物疫病。ASF发病症状与普通猪瘟相似，临床上很难鉴别诊断，只能依靠实验室检测确诊，目前还没有有效疫苗和防治药物。ASF只对猪高度感染，还未发现ASFV感染人现象。

ASFV是直径为200 nm的正二十面体双链DNA病毒,DNA核心直径为70～100 nm，外周是直径为170～190 nm的衣壳和含类脂的囊膜。该病毒对生存环境非常耐受，在粪便内可存活11 d（室温），熏肉和腌肉中可存活1～6个月，干肉中可存活10个月，冻肉中可存活3年以上。ASFV主要通过巨胞饮和网格蛋白介导的胞吞方式进入宿主细胞[1]，主要感染猪网状内皮细胞和单核巨噬细胞，引发细胞凋亡，严重影响宿主免疫系统。

1 流行病学及诊断

1921年，东非国家肯尼亚首次确认非洲猪瘟疫情，随后，ASF在非洲流行。1957年首次传入欧洲（葡萄牙），1971年传入美洲（古巴），2007年，首次传播至欧亚接壤的格鲁吉亚，随后传入亚美尼亚、阿塞拜疆和俄罗斯，并在高加索地区定殖。2012年传入乌克兰，2013年传入白俄罗斯，2014年传入拉脱维亚、爱沙尼亚。2017年，非洲猪瘟疫情以地中海和高加索山脉为基地，继续西进和东扩，向西传入捷克、罗马尼亚，向东到达俄罗斯的秋明州、额尔斯克等西伯利亚地区[2-3]。2018年8月，我国辽宁确诊首例疫情，之后我国多地检出非洲猪瘟疫情，截至2019年2月，已有24个省份发生过家猪和野猪非洲猪瘟疫情。

ASFV传播有多种途径：一是直接接触传播，包括家猪-家猪、家猪-野猪、野猪-野猪之间的直接接触传播；二是经环境间接传播，ASFV对外界环境抵抗力较强，在粪便中可存活11 d，在受污染猪圈内可存活1个月，在腐烂血液中可存活15周，污染环境（猪舍、车辆、衣服、工具等）处理不彻底常是ASF反复暴发的重要原因；三是经软蜱传播，软蜱是ASFV的储存宿主，软蜱的交配和产卵也是病毒传播的途径，且病毒可在软蜱组织内存活数年时间。ASFV是一种蜱传的大型DNA病毒，在猪、野猪和软蜱之间具有复杂的传播周期，并编码150多种且一半功能未知的病毒蛋白。该病毒显示出高遗传和抗原多样性，全球已鉴定出24种基因型和8种血清群。

ASF症状复杂，难以和普通猪瘟区别诊断，存活猪也常成为病毒携带者，继续感染其他健康猪。猪感染ASFV后虽可产生特异性抗体，但目前为止还没有发现这些抗体具有中和作用和保护效果。根据流行病学、临床症状和病理解剖可对ASF做出初步诊断，但确诊需要通过病原检测（包括琼脂扩散试验、补体结合反应、免疫荧光技术和血吸附试验等）、血清学检测（间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、荧光抗体法等）和分子生物学检测（DNA原位杂交、常规PCR、实时荧光定量PCR等）[4]。

2 致病机理

ASFV主要经呼吸道和消化道进入猪体内，病毒感染机体后，首先在扁桃体中进行增殖，而后伴随血液和淋巴系统侵入全身，引发病毒血症，并在血管内皮细胞、巨噬细胞内进行复制，侵袭血管和淋巴管，造成相应器官组织出现浆液性渗出、出血、血栓和坏死等病理变化。病死猪经常表现出全身组织器官出血、免疫系统受损、淋巴细胞减少等症状[5]。

ASFV感染的靶细胞主要是猪单核-巨噬细胞，此外也感染树突状细胞、内皮细胞、巨核细胞等。病毒入侵细胞须受体-配体介导，但ASFV的受体和配体还不明确，病毒在受体介导下，通过巨细胞饮和网格蛋白介导的胞饮两种方式进入细胞，并在细胞内进行病毒的复制和包装等[1]。

3 基因组研究

ASFV基因组为末端共价闭合的单分子线状双链DNA，长度为170～190 kb，基因组中央区是长约125 kb的保守区，两端序列长度变化较大（左侧约48 kb，右侧约22 kb），两端基因区含有数个多拷贝基因家族。由于两端基因拷贝数不同，导致不同毒株间的基因长度差异较大。ASFV整个基因组含有150多个开放读框（ORF），可以编码150～200种蛋白质[6]。

ASFV编码的蛋白质众多，按其功能可分为5类，即执行DNA复制、修复和RNA转录功能的蛋白，病毒组装和结构蛋白，机体免疫调控蛋白，多拷贝基因家族和其他未分类蛋白[7]。

3.1 执行DNA复制、修复和RNA转录功能的蛋白

参与DNA复制的ASFV基因有G1211R（编码DNA聚合酶B）、E301R（编码PCNA样蛋白）、C962R（编码核苷三磷酸酶）、F1055L（参与起始点复制）等[8-9]。ASFV入侵巨噬细胞后，巨噬细胞会激发活性氧反应机制破坏病毒基因组，ASFV可启动一系列基因表达修复DNA破损[10-11]，如由O174L（编码DNA聚合酶X）、NP419L（编码ATP依赖的DNA连接酶）和E296R（编码脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶）组成的最小DNA修复机制。不同于其他病毒，ASFV的复制、修复和转录大多依靠自身基因表达完成[8]，如 由EP1242L、C147L、NP1450L、H359L、D205R和CP80R编码蛋白组成的病毒RNA聚合酶Ⅱ，G1340L、I243L等编码的阶段性转录调控因子，以及参与转录本头尾端修饰的NP868R编码蛋白等[12]。

3.2 病毒组装和结构蛋白

参与ASFV组装的蛋白有20多种[13-15]。pp220多聚体蛋白（CP2475L）酶切后的p150、p37、p34、p14蛋白，pp60（CP530R）酶切后的p35和 p15蛋白，以及SUMO样蛋白（S273R）共同组成病毒核心壳，核心壳外包裹有源于内质网的单层脂膜形成的正20面体荚膜。ASFV荚膜上含有p72蛋白（B646L）及其伴侣蛋白（B602L）和 p49蛋 白（B438L）。ASFV 内膜上含有 p17（D117L）、p54（E183L）、j18L（E199L）和j5R（H108R）等膜蛋白。E120R编码蛋白位于细胞内病毒粒子的表面，可将病毒从装配点传送至膜表面。

3.3 机体免疫调控蛋白

ASFV之所以引发极高的感染率和致死率，其原因在于表达多种宿主免疫调控蛋白，操控巨噬细胞，对抗先天免疫和获得性免疫，促进病毒复制、增殖和感染[16-18]。如A238L编码蛋白可抑制宿主NF-κB等免疫调控基因的转录，I329L编码蛋白可抑制Toll样受体3信号通路，MGF360和MGF530多拷贝基因可抑制Ⅰ型干扰素反应，DP71L编码蛋白可阻止PKR或PERK等激酶磷酸化诱导的蛋白合成。此外，ASFV也编码一些黏附蛋白来促进受感染细胞和病毒颗粒与细胞外环境基质的连接[19]，如CD2v蛋白胞外区序列与人CD2具有较高的同源性，其可以介导红细胞与受感染细胞或病毒颗粒的结合，同时，CD2v也会抑制机体淋巴细胞增殖。EP153R编码的蛋白是Ⅱ型跨膜蛋白，含有一个和NK细胞受体相似的结构域（C型凝集素），借助该结构域，EP153R可抑制细胞MHCⅠ类抗原上调和受感染细胞凋亡，促进病毒增殖。

3.4 多拷贝基因家族

ASFV基因组两端含有一些重复可变区序列以及一些编码基因，如MGF100、MGF110、MGF300、MGF360、MGF505/530和p22。每个基因都有多个拷贝，基因头尾方向一致且紧密排列，执行特定的生理学功能[20]。

4 疫苗研究

鉴于ASFV对养猪业和国家经济及食品安全造成的巨大影响，疫苗研制成为许多科学家的研究主题，研究疫苗包括灭活疫苗、减毒疫苗、基因工程疫苗、亚单位疫苗和核酸疫苗等[21]。但迄今所有针对ASF的疫苗研发生产都告以失败，主要原因是ASFV有一套完整的抗宿主疫苗应对机制。ASFV基因组可编码多种蛋白质，用于干扰宿主的天然免疫系统，从而抑制和逃避免疫应答反应，为自身增殖和扩散创造有力条件。

4.1 灭活疫苗

灭活疫苗通过物理或化学手段将病原体灭活，使其失去感染能力，但保留其抗原性。科学家们尝试通过各种方法研制灭活ASF疫苗，包括经加热和甲醛等方法灭活的ASFV、用ASFV接种的肺泡巨噬细胞悬浮液制备的灭活疫苗、ASFV感染猪脾组织匀浆并经弗氏佐剂乳化制备的灭活疫苗等，均未能提供有效的免疫保护[22]，即使借助Polygen或Emulsigen-D等免疫增强剂，ASF疫苗仍然没有产生有效的保护[23]。

4.2 减毒疫苗

减毒疫苗是指致病力减弱但仍具有活力的完整病原疫苗。依据制备工艺，减毒疫苗可分为天然减毒株、传代减毒株和基因工程重组减毒株3类。和灭活疫苗相比，减毒疫苗能够诱导强烈持久的免疫应答，但安全性是重点考虑的因素。目前报道的ASF减毒疫苗包括OURT88/3、NH/P68等天然弱毒株和猪骨髓源细胞，Vero细胞和COS-1细胞等传代致弱毒株，但这些减毒疫苗均没有产生有效的免疫应答，而一些疫苗在使用时还酿成严重的生物安全事故。如1963年，Manso等证实通过猪骨髓细胞传代的ASF减毒疫苗可抵抗强毒株攻击，随后该疫苗在西班牙和葡萄牙进行了田间试验，却造成了灾难性后果，免疫后的猪均出现肺炎、流产和死亡等免疫副作用，且出现大量病毒携带者，后续随访观察证实这些免疫动物即使没有ASF强毒株攻击，很多仍会出现慢性感染，死亡率为10%～50%。很多病毒携带者虽能长时间保持健康，但大多数最终发展为慢性肺炎或因急性发作而死亡。

基因工程减毒疫苗是指采用分子生物学方法，敲除病毒毒力基因或免疫抑制基因，降低病毒毒力或增加机体对病毒的免疫应答，生产出比传统减毒疫苗安全且效力更高的减毒活疫苗。已有研究表明，删除ASFV的某些毒力基因，如TK、B119L[24]、DP71L[25]、MGF360/505[26]，减毒疫苗接种宿主后毒力减弱且呈现出一定的免疫保护效果。ASFV表达多种蛋白用于调控和逃避机体免疫，通过基因工程手段失活病毒的免疫调控基因如A238L[27]、CD2v编码基因[19]、C 型凝集素编码基因[28]等，也有助于增强减毒疫苗的免疫反应。

4.3 亚单位疫苗

将含有中和表位的病毒保护性抗原基因通过原核和真核细胞表达，纯化收获的蛋白亚单位疫苗是新一代疫苗发展趋势。与传统灭活疫苗和减毒疫苗相比，亚单位疫苗在不降低保护效率的前提下，其安全性也会有较大的提升。p72、p30和p54是ASFV感染后引发机体体液免疫的3个主要抗原，目前ASF亚单位疫苗研究也主要集中在这3种靶标上[29-30]，但研究结果均不理想。如同时免疫含有p30和p54的亚单位疫苗，虽然在猪体内检测到高滴度的相应抗体，但病毒感染结果显示该疫苗只能提供50%的生存保护率，且存活宿主体内仍然含有较高的ASFV[31]；另一研究显示用杆状病毒表达的p30、p54、p72和p22联合疫苗虽然能激发机体产生高滴度的中和性抗体，但ASFV感染试验却完全没有显示出保护效能[32]。

CD2v是另一个ASFV亚单位疫苗研究的热点靶标，CD2v（EP402R编码）蛋白位于病毒外膜，是与细胞CD2分子同源的蛋白，具有红细胞吸附功能。研究显示CD2v免疫猪可产生抗血红素吸附抗体和抗单核细胞感染抗体，且对同型毒株产生部分保护作用[19]。此外，将CD2v和EP153R组成的嵌合疫苗也只能提供部分免疫保护[33]，提示除了CD2v等抗原外，还需要其他更多抗原的介入。研制ASF亚单位疫苗，需要对ASFV蛋白有更进一步的了解。

4.4 核酸疫苗

核酸疫苗制备简单、成本低廉，可同时表达多种抗原且无毒力逆转的危险，被称为继减毒疫苗、亚单位蛋白疫苗之后的第三代疫苗。ASF核酸疫苗大多是将ASFV保护性抗原基因构建成真核表达载体进行制备免疫，不过其免疫疗效相比于蛋白疫苗也未获得明显提高，仍然不能提供有效保护。如用CD2v、p30和p54等3种蛋白胞外区编码基因组成的三联DNA疫苗免疫动物，也只有25%的保护效果[34]。Lacasta等通过表达文库构建了4029个表达质粒，进行了免疫攻毒保护试验，其保护率只能达到60%，不过免疫攻毒后存活的猪无排毒现象[35]。

4.5 基于ASFV受体和保护性抗原的疫苗研究

目前介导ASFV入侵细胞的受体和关键抗原还不明确。细胞攻毒保护试验曾发现CD163是ASFV的受体，CD163表达强弱与ASFV感染程度具有正相关性，但利用CRISPR/Cas9敲除CD163基因的转基因猪并没有显示出对ASFV的有效抵抗力，证明CD163不是ASFV的受体[36]。研究表明p12蛋白可能是介导病毒入侵的关键抗原，但在ASFV感染细胞实验中，加入过量p12抗体并没有有效阻断病毒结合和感染，提示p12并不是介导病毒吸附的惟一抗原。研究显示p32、p72和p54在病毒吸附细胞过程中也具有重要作用[32,37]，p72和p54可促进病毒和巨噬细胞的结合，而p32有助于病毒内化。ASFV的受体是哪些，有待进一步深入探讨。

5 结语

非洲猪瘟作为一种重要的动物疫病，具有传染性强、死亡率高、缺少有效的疫苗预防等特征。开展对ASFV的相关研究，尤其是病原学和病毒免疫逃逸研究尤为重要。ASFV具有复杂的基因结构，编码表达大量病毒复制非必需蛋白，弄清这些蛋白的功能，分析病毒免疫逃逸的机理和致病机制，寻找病毒入侵细胞的关键抗原和细胞受体，将为ASF的防控奠定理论基础，并对疫苗开发和疾病防控提供指导作用。