三江平原湿地小叶章叶片叶绿素荧光特性对水分梯度的响应

伍一宁，钟海秀，王继丰，隋 心，张荣涛，李金博，王丽媛，张 玉，王世标，许 楠，邹红菲

（1. 东北林业大学野生动物资源学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2. 黑龙江省科学院自然与生态研究所，黑龙江 哈尔滨 150040；3. 黑龙江大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150080；4. 环境保护监测站，内蒙古 赤峰 024076）

湿地生态系统虽然仅占陆地面积的4%～6%，但湿地是陆地生态系统最为重要的“碳库”或“碳汇”，湿地生态系统中动植物资源丰富，具有重要生态价值[1-3]。三江平原湿地是由黑龙江、松花江、乌苏里江冲积而形成的低平原, 是我国最大的沼泽湿地集中区，并于2002年被列入国际重要湿地名录[4]。三江平原湿地在调节当地气候、控制湿室气体排放和碳固定方面发挥着重要的作用，具有重要的生态价值。目前由于人类的大面积湿地垦殖，湿地生态系统遭到破坏。三江平原由于近几十年来的大规模过度开发，湿地面积已大量减少，水土流失日趋严重，生物多样性锐减，环境污染与日俱增[5-6]。

湿地退化的主要表现为水分含量的降低，直接会导致湿地土壤有机碳的矿化、湿室气体排放量增加、全球气候变化。水分是影响湿地生态系统生物多样性的重要因素之一[7-8]，已有研究表明，不同水分梯度下三江平原湿地特种组成及多样性[9-10]、土壤细菌[11]、真菌[12]多样性、土壤酶活性[13]等均发生了明显的变化。水分也是影响植物生理功能的重要限制因子，不同植物对水分的需求量明显不同，干旱或水分过多均会限制植物的生理功能[14-15]，但是湿地植物由于生长在长期或季节性淹水条件下，使其具有独特的生理生态适应机制。目前，关于对不同水分梯度下湿地植物漂筏苔草(Carex pseudocuraica)[16-17]、小叶章(Deyeuxia angustifolia)[18]等植物生长方面的研究已有报道，但是关于不同水分梯度下湿地优势植物小叶章光合生理适应性方面的研究尚不多见，既然小叶章能作为三江平原湿地的典型优势种，那么小叶章对不同水分环境下的生理适应机制是什么？光合能力是植物维持正常生长的基础保障，特别是植物光合作用中PSII功能在植物对光能的吸收和利用方面具有重要的意义，而PSII又是对环境因素比较敏感的部位之一，逆境条件下常常导致植物PSII功能降低，甚至发生光抑制现象[19-20]。为此，本研究选择三江平原湿地内典型的沼泽(常年积水)、沼泽化草甸(季节性积水)和草甸(地表无积水)3 个不同水分梯度下湿地类型小叶章为试验材料，利用叶绿素荧光动力学技术研究了不同水分梯度下湿地小叶章叶片的PSII功能变化，拟通过光合功能方面来揭示小叶章对水分梯度的适应机理，以期为三江平原湿地优势植物小叶章的深入研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验样地概况

试验样地设在黑龙江省洪河国家级保护区(47°45′39″ N, 133°37′04″ E)，该地区海拔 55-65 m，属温带湿润半湿润季风气候，全年平均降水量约为600 mm，降水主要集中在夏秋两季，全年平均气温1.9 ℃，无霜期约为125 d[21]，本试验样品采集区域位于整个洪河保护区的核心区域，湿地优势植物主要有小叶章和漂筏苔草，伴有少量的狭叶甜茅(Glyceria spiculosa)、毛果苔草(Carex lasiocarpa)等。

不同水分梯度湿地土壤样品的采集及含水率测定：分别选择典型沼泽(常年积水)、沼泽化草甸(季节性积水)和草甸(地表无积水)3个不同水分梯度湿地类型，每个水分梯度类型内按“S型”各取5个点土样进行混合，采样深度0～20 cm，沼泽排除水面采取0～20 cm土样。土壤样品用塑料封口袋带回实验室后，采用烘干法进行土壤含水率的测定。土壤含水率分别为185%、86%和75%。每个湿地类型内选择5株长势相对一致的小叶章，分别测定其PSII反应中心的光化学活性。

1.2 测定项目及其方法

1.2.1 测定快速叶绿素荧光动力学 (OJIP)曲线

利用暗适应夹将不同水分梯度下湿地小叶章叶片进行30 min的暗适应，然后利用Handy-PEA植物效率仪测定叶片的OJIP曲线，OJIP曲线由3 000 μmol·(m2·s)-1的脉冲红光诱导。每个处理测定 5 次重复，按照每次重复OJIP曲线各时间点的荧光强度求其平均值，按照平均值绘制OJIP曲线，曲线横坐标以对数形式表示。为分别确定J、I、K和L 4个特征点的相对可变荧光VJ、VI、VK和VL，分别将OJIP曲线进行O-P、O-J和O-K标准化[22]。在曲线中，O、L、K、J、I和P点对应的时刻分别为 0、0.15、0.3、2、30 和 1 000 ms，通过对曲线O-P阶段进行标准化得出各点的相对可变荧光VO-P= (Ft- Fo) / (Fm- Fo)，对 O-J 阶段进行标准化得出各点的相对可变荧光 VO-J= (Ft- Fo) / (FJ-Fo)，O-K 标准化时各点的相对可变荧光 VO-K= (Ft- Fo) /(FK-Fo)， 式中：Ft表示各时间点的荧光强度，Fo、FK、FJ、Fm分别为O、K、J和P点的相对荧光强度。分别用沼泽化草甸及草甸小叶章的标准化O-P、O-J和O-K曲线与沼泽小叶章作差值，差值分别以△VO-P、△VO-J和△VO-K表示。通过JIP-test软件分析得出植株叶片的PSII最大光化学效率(Fv/ Fm)和以吸收光能为基础的光合性能指数(PIABS)[23]。

1.2.2 测定植物叶片叶绿素荧光光响应曲线

对植株叶片仪器自带暗适应夹进行暗适应25～30 min后，使用便携调制式荧光仪(FMS-2，Hansatech, 英国)测定最大荧光(Fm)、初始荧光(Fo)，随后利用FMS-2的内置光源分别设定100、200、400、600、800 和 1 000 μmol·(m2·s)-1的不同光强的作用光，在设定的光强下适应 3 min后测定其叶片的荧光参数光适应下的最大荧光(Fm′)、光适应下的最小荧光(Fo′)及稳态荧光(Fs)，分别计算不同作用光下的实际光化学效率(ФPSⅡ)和电子传递速率 (ETR)，ФPSⅡ= (Fm/ Fs) / Fm′，ETR = 0.5 ×0.85 × ФPSⅡ× PFD， 式中 PFD 为光照强度，并绘制ФPSⅡ和ETR 的光响应曲线。

1.2.3 测定 PSII反应中心光能分配参数

对不同水分梯度下湿地小叶章叶片利用仪器自带的暗适应夹进行25～30 min的暗适应，利用FMS-2按照Hendrickson等[24]和Zhou等[25]的方法测定PSII反应中心吸收光能的分配去向：用于光化学反应的量子产额(ФPSⅡ)、依赖于类囊体膜两侧质子梯度和叶黄素循环的量子产额(ФNPQ)、基本的荧光量子产额和热耗散的量子产额(Фf,D)以及失活PSII反应中心的热耗散量子产额(ФNF)，其中各部分参数的计算方法为：

式中：Fs为稳态荧光，Fv为可变荧光，Fm′为光适应下的最大荧光，Fv/ FmM为未发生光抑制时的最大光化学效率。其各部分的总和计为 1，即ФNF+ ФPSⅡ+ФNPQ+ Фf,D= 1。

1.3 数据处理和统计方法

数据测定为5次重复的平均值 ± 标准差(SE)，运用Excel进行数据平均值测定，SPSS(23.0)软件对试验数据进行标准差统计分析，并采用单因素方差分析(One-way ANOVA)和最小显著差异法(LSD)比较不同数据组间的差异。

2 结果与分析

2.1 不同水分梯度下湿地小叶章叶片的OJIP曲线

不同水分条件下小叶章叶片的OJIP曲线形态明显不同。沼泽化草甸和草甸小叶章叶片的OJIP曲线形态比较相似。与沼泽小叶章相比，沼泽化草甸和草甸小叶章叶片O点的相对荧光强度Fo均明显降低，而P点的相对荧光强度Fm则呈明显的增加趋势，J点相对荧光强度在不同水分梯度下变化不明显，而沼泽化草甸和草甸小叶章叶片I点相对荧光强度较沼泽也明显增加，但其增加幅度明显小于P点的增加幅度(图1)。定量分析Fo和Fm的变化结果(图2)可以看出，沼泽化草甸和草甸小叶章叶片的Fo分别较沼泽降低了29.33%和24.08%，均达极显著差异水平(P＜0.01)，而Fm则分别增加了 14.57% 和 19.88%，差异均不显著 (P ＞ 0.05)。

2.2 不同水分梯度下湿地小叶章叶片的 Fv/Fm和PIABS

沼泽小叶章叶片的Fv/ Fm分别低于沼泽化草甸和草甸19.27%和18.50%，差异均显著(P＜0.05)；沼泽小叶章叶片PIABS分别低于沼泽化草甸52.54%，低于草甸72.73%，差异不显著(P ＞ 0.05)。沼泽化草甸和草甸小叶章叶片的Fv/Fm和PIABS均不显著(P ＞ 0.05)(图 3)。

图1 不同水分梯度湿地小叶章叶片的OJIP曲线Figure 1 Chlorophyll fluorescence characteristics of Deyeuxia angustifolia leaves across a water gradientO, 最低荧光; P, 荧光最高峰; J 和 I, O-P 点的变化中的拐点; Ma,沼泽; Ml, 沼泽化草甸; Me, 草甸。下同。O, Minimal recorded fluorescence; P, Maximal recorded fluorescence; J and I, The inflection point in the change of O-P;Ma, mash wetlands; Ml, mash meadow wetlands; Me, meadow;similarly for the following figures.

图2 不同水分梯度湿地小叶章叶片的Fo和FmFigure 2 Fo and Fm of Deyeuxia angustifolia leaves under different water gradients不同大小写字母分别表示差异极显著 (P＜0.01)和显著 (P＜0.05)。下同。Different capital and lowercase letters indicate significant difference at 0.01 and 0.05 level, respectively；similarly for the following figures.

2.3 不同水分梯度下湿地小叶章叶片的标准化O-P、O-J和O-K曲线

分别将不同水分梯度小叶章叶片的OJIP曲线上O点相对荧光强度定义为0，P、J和K点相对荧光强度定义为1，把原始OJIP曲线按O-P、O-J和O-K标准化后可以看出(图4)，标准化O-P曲线上J点和I点相对可变荧光(VJ和VI)、标准化O-J曲线上K点相对可变荧光(VK)和标准化O-K曲线上L点相对可变荧光(VL)均出现明显的差异，通过△VO-P、△VO-J和△VO-K也可以看出，沼泽化草甸和草甸小叶章叶片VJ、VK和VL均明显低于沼泽。

图3 不同水分梯度湿地小叶章叶片的 Fv / Fm 和 PIABSFigure 3 Fv / Fm and PIABS of Deyeuxia angustifolia leaves under different water gradients

图4 不同水分梯度湿地小叶章叶片的标准化O-P、O-J和O-K曲线及其差值Figure 4 O-P, O-J and O-K curve of Deyeuxia angustifolia leaves under different water gradients

2.4 不同水分梯度下湿地小叶章叶片 J、K 和L点相对可变荧光

定量分析标准化O-P、O-J和O-K曲线上各特征点的相对可变荧光(VJ、VK和VL)变化可以看出(图5)，湿地水分含量的降低均明显导致了小叶章叶片VJ、VK和VL的降低，但其降低幅度不同。与沼泽相比，草甸小叶章叶片VJ、VK和VL的降低幅度稍大于沼泽化草甸，但二者间差异均未达显著水平(P ＞ 0.05)。虽然沼泽化草甸小叶章叶片的VJ和VK与沼泽之间差异均不显著(P ＞ 0.05)，但草甸小叶章叶片的VJ和VK却均显著低于沼泽小叶章(P＜0.05)。另外，沼泽化草甸和草甸小叶章叶片的VL分别低于沼泽小叶章10.58%和13.41%，均差异显著 (P＜0.05)。

图5 不同水分梯度湿地小叶章叶片的VJ、VK和VLFigure 5 VJ, VK and VL of Deyeuxia angustifolia leaves under different water gradients

2.5 不同水分梯度下湿地小叶章叶片叶绿素荧光参数的光响应曲线

随着光照强度的增加，小叶章叶片的实际光化学效率ФPSⅡ呈降低趋势（图6），而电子传递速率ETR则呈先增加后降低趋势。不同水分梯度下小叶章叶片的ФPSⅡ和ETR却明显不同，在光照强度为 100 和 200 μmol·(m2·s)-1时，3 个水分梯度下小叶章叶片的ФPSⅡ和 ETR 均无显著差异 (P ＞ 0.05)，但随着光照强度的进一步增加，沼泽小叶章叶片的ФPSⅡ降低幅度以及ETR的增加幅度均低于沼泽化草甸和草甸小叶章，而沼泽化草甸小叶章叶片的ФPSⅡ和ETR虽也稍低于草甸小叶章，但二者差异水平较小。

2.6 不同水分梯度湿地小叶章叶片 PSII 反应中心能量分配参数

不同水分梯度下小叶章叶片PSII反应中心吸收光能的分配参数(Ф)明显不同(图7)。与沼泽相比，当水分含量降低后，沼泽化草甸和草甸小叶章叶片的ФPSⅡ分别增加了5.49%和6.23%，而ФNPQ均没有发生明显变化，Фf,D和ФNF则有不同程度的降低。

图6 不同水分梯度下湿地小叶章叶片叶绿素荧光参数的光响应曲线Figure 6 Chlorophyll fluorescence curve of Deyeuxia angustifolia leaves under different water gradients

3 讨论

长期的淹水会抑制植物的生长，其原因主要是由于根系低氧环境造成根系活力降低引起其呼吸速率减慢，甚至造成无氧呼吸[26]，淹水还会影响植物的光合能力，造成植物叶片叶绿素含量的降低、气孔关闭、光合能力降低等[27]。植物在淹水胁迫后会导致植物叶片细胞的超微结构受到伤害、其叶片中的光合酶活性和PSII反应中心活性将会降低[28-29]。但是由于水生植物根系的独特结构，对淹水具有极强的适应能力。那么水生植物针对季节性淹水以及当水分退去后植物体自身的生理适应性会发生什么变化？特别是典型的湿地植物在湿地退化后是否具有对不同水分梯度的适应能力，是决定其能否成为建群种的关键。植物的光合能力是植物对环境影响较为敏感的生理过程之一，叶绿素荧光技术是研究植物光合机构特别是PSII功能的重要手段之一[30]。本研究中通过利用快相叶绿素荧光动力学技术研究了三江平原湿地典型植被小叶章PSII功能对不同水分梯度的影响，结果发现，与长期淹水沼泽小叶章相比，季节性淹水的沼泽化草甸和地表无淹水的草甸小叶章叶片Fv/ Fm和 PIABS均有不同程度的增加，Fv/ Fm和 PIABS均为反映植物PSII光化学活性的重要指标，说明沼泽化草甸和草甸小叶章叶片的PSII光化学活性均较处于长期淹水条件下的小叶章有所增加，这可能是由于较低的土壤水分或淹水非淹水交替作用下小叶章根系获得充足的O2供应有关，另外，草甸小叶章叶片的Fv/ Fm和PIABS均稍高于沼泽化草甸小叶章，这进一步验证了在土壤供氧量增加时，更有利于小叶章叶片的光合功能增强。为进一步分析不同水分梯度条件下小叶章叶片具有不同PSII光化学活性的原因，将不同处理下小叶章叶片的OJIP分别进行了标准化，并且分析了标准化曲线上各特征点的相对可变荧光变化，结果发现，与沼泽小叶章相比，沼泽化草甸和草甸小叶章叶片标准化O-P、O-J和O-K曲线上各特征点的相对可变荧光VJ、VK和VL均明显降低，特别是草甸小叶章叶片VJ、VK和VL降低更为明显。标准化O-P曲线上2 ms处J点相对可变荧光VJ可以反映QA

-的积累量，即VJ的增强说明PSII受体侧QA到QB的电子传递受阻[31-32]，标准化O-J曲线上0.3 ms处K点得出相对可变荧光VK的增加被认为是PSII电子供体侧放氧复合体OEC活性受到伤害的重要标志[33]，标准化O-K曲线上0.15 ms处L点相对可变荧光VL的增加被认为是类囊体膜受到破坏的重要标志。因此，与长期淹水的沼泽小叶章相比，沼泽化草甸和草甸水分降低后小叶章叶片PSII受体侧的电子传递速率和供体侧的放氧复合体OEC的活性均有不同程度的增加，并且相对提高了小叶章叶片的类囊体膜的稳定性，这均是导致其PSII光化学活性有所增加的重要原因。小叶章光合PSII功能的增强，对维持叶片的正常光合碳同化能力，促进小叶章的生长具有重要的意义，这与王丽等[18]的研究发现无常年积水小叶章群落生物量大于常年积水群落的结果相吻合。

图7 不同水分梯度湿地小叶章叶片PSII反应中心能量分配参数Figure 7 PSⅡenergy allocation pathways in leaves of Deyeuxia angustifolia leaves under different water gradientsФPSⅡ，光化学反应的量子产额；ФNPQ，依赖于类囊体膜两侧质子梯度和叶黄素循环的量子产额；Фf, D，基本的荧光量子产额和热耗散的量子产额；ФNF，失活 PSII 反应中心的热耗散量子产额。ФPSⅡ, the amount of photochemical reactionQuantum yield；ФNPQ, depends on the thylakoid membranes and on both sides of the proton gradient; Фf, D,The quantum yield of lutein circulation and a basic load of fluorescent zi chan Quantum yield of heat dissipation; ФNF, the deactivation PSII reactionThe heat dissipation quantum yield of the center.

叶绿素荧光参数ФPSⅡ和ETR的光响应曲线可以用来分析植物对光强的利用能力[34]。虽然在100 和 200 μmol·(m2·s)-1时，3 个水分梯度下小叶章叶片的ФPSⅡ和ETR均无显著差异，但随着光照强度的进一步增加，沼泽小叶章叶片的ФPSⅡ降低幅度以及ETR的增加幅度均明显低于沼泽化草甸和草甸小叶章，而沼泽化草甸小叶章叶片的ФPSⅡ和ETR虽也稍低于草甸小叶章，但二者差异水平较小。这说明与长期淹水状态下的沼泽小叶章相比，沼泽化草甸和草甸小叶章叶片的光能利用能力增强，特别是对高光强的利用能力更明显高于沼泽小叶章。另外，通过对PSII反应中心吸收光能分配去向的研究结果也可以发现，与沼泽小叶章相比，当土壤水分含量降低后，沼泽化草甸和草甸小叶章叶片的ФPSⅡ均明显增加，说明与长期淹水状态下沼泽小叶章相比，沼泽化草甸和草甸小叶章叶片吸收光能用于光化学反应的比例较高，这对于维持正常的光合电子传递，保证同化力(NADPH和ATP)的供应起到了积极作用。与长期淹水沼泽小叶章相比，沼泽化草甸和草甸小叶章叶片的ФNPQ均没有发生明显变化，但Фf,D和ФNF则有不同程度的降低，这说明与长期淹水状态下小叶章相比，土壤含水量降低时小叶章叶片激发能以无效热能形式耗散的比例降低，并且分配到失活反应中心的能比例也有所降低，这对于维持小叶章叶片的正常光合电传递能量供应发挥了重要的作用。

4 结论

与长期淹水状态下沼泽小叶章相比，湿地土壤水分退去后，沼泽化草甸和草甸小叶章叶片的PSII功能均有不同程度地提高，主要表现为PSII光化学效率增加，PSII供体侧放氧复合体OEC的活性及PSII受体侧的电子传递能力均有所提高，对光能的利用能力特别是对强光的利用能力增强，光能利用及分配情况优化，这可能是导致沼泽化草甸及草甸湿地类型中小叶章成为优势种的重要原因之一。但沼泽化草甸和草甸小叶章叶片的PSII功能差异较小。