基于PCR检测和基因测序分析的鹿源副结核分枝杆菌鉴定及亚型分型

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副结核病(paratuberculosis)也称Johne’s disease，其病原是禽分枝杆菌副结核亚种(Mycobacteriumaviumsubsp.paraenberculosis，MAP)。该菌可引起反刍兽慢性消耗性传染病，临床特征主要表现为慢性卡他性肠炎、顽固性腹泻和进行性消瘦，病理学特征为慢性增生性肠炎，剖检可见肠黏膜增厚并形成皱襞[1]。反刍动物如牛、绵羊、山羊、骆驼和鹿对本菌易感。副结核病是一种人兽共患慢性感染性疾病，不仅对养殖业带来严重的经济损失，同时也对公共卫生安全造成威胁。世界动物卫生组织(OIE)将其列为B类疫病，我国被列为二类动物疫病。

由于大多数情况下，感染副结核病的马鹿处于亚临床状态，即不表现出明显临床表现，或症状不典型。因此，仅通过临床诊断来判断马鹿是否感染副结核病就存在一定的局限性。目前，细菌分离培养法是当今世界上推荐的活体定性最准确和可靠的方法，由于初代分离极为困难，检出率低，亚临床感染的动物粪便采用培养方法可能不能获得该菌，易导致试验结果假阴性，且耗时、费用高，在群体检测中的应用受到很大限制。相比较细菌学诊断、变态反应诊断、血清学诊断，PCR方法能及早诊断、缩短检测时间、特异性高，是目前诊断副结核病最为快捷的方法[1]。

马鹿是我国重要的经济动物和野生动物，副结核病已成为危害养鹿业重要传染病之一，直接或间接造成严重的经济损失。因此，开展马鹿副结核病研究对疫病防控具有重要意义。鉴于副结核分枝杆菌进行常规的细菌分离鉴定耗时长、亚型无法确定的特点，本研究采用PCR检测和基因测序分析技术，结合临床观察、病理观察，对新疆某规模鹿场疑似感染副结核病样品进行PCR病原鉴定，为该病的诊断、防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1样品采集无菌采取新疆某地养鹿场编号为34T-44号、34T-45号的病死马鹿的肠系膜淋巴结、小肠样品。其中，用于组织触片抗酸染色的小肠组织进行冷藏保存，用于DNA提取的肠系膜淋巴结冷冻保存，用于病理组织切片检查的小肠样品保存于4%多聚甲醛固定液。

1.1.2主要试剂血液/细胞/组织DNA提取试剂盒、2×Taq PCR MasterMix、pGM-T克隆试剂盒、质粒小提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、TIANgel Midi Purification Kit试剂盒等均购于天根生化科技(北京)有限公司。抗酸染色试剂、4%多聚甲醛固定液，由本实验室配制保存。

1.1.3仪器PCR仪(TC-5000，购自英国TECHNE公司)，小型高速冷冻离心机(Centrifuge 5415R，购自Eppendorf公司)，电泳仪(Thermal cycler Block，购自Thermo Fisher公司)，凝集成像仪(Gel DocTM XR+，购自Bio-RAD公司)。

1.2 方 法

1.2.1发病调查新疆某养鹿场部分马鹿出现持续性腹泻，发病马鹿经抗生素治疗病情有所缓解，过数日后再次出现复发现象。发病马鹿年龄多在1.5～3岁之间，舍饲隔离管理。部分马鹿失去生产性能，给养殖户造成严重的经济损失。

1.2.2临床症状发病马鹿表现消瘦、精神萎靡，食欲减退，被毛粗乱、无光泽。粪便呈稀糊状或稀液状并带有恶臭味，粪便中有的带有灰白色粘液或脱落的粘膜。经治疗后腹泻症状有减缓或停止，但经数日再次复发。

1.2.3病理变化剖检2只发病死亡马鹿(编号34T-44、34T-45)，皮下水肿，局灶性胶冻样浸润，肠系膜淋巴结肿大，呈条索状，质地柔软，切面外翻、湿润，肠系膜水肿、增厚，呈胶冻样。回肠、空肠、盲肠体、回盲瓣部位黏膜增厚。

1.2.4 实验室检查

1.2.4.1细菌学检查取病变明显的小肠黏膜组织做触片，萋-尼氏法抗酸性染色，镜检观察并记录结果。

1.2.4.2病理组织学检查取4%多聚甲醛溶液中组织块(小肠)，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、石蜡切片、萋-尼氏法抗酸染色法，镜检组织学病理变化、染色特性。

1.2.4.3PCR鉴定取34T-44、34T-45马鹿冷冻保存的肠系膜淋巴结，研磨，反复冻融3次，依照说明书操作提取DNA，于-80 ℃保存备用。

副结核分枝杆菌的IS900鉴定引物来源于参考文献[2]，IS900分子鉴定引物序列如下P90：5′-GTTCGGGGCCGTCGCTTAGG-3′，P91：5′-GAGGTCGATCGCCCACGTGA-3′，预计扩增片段为400 bp。

PCR反应体系(25 μL)：Go Tap Green Master Mix 12.5 μL，引物Primer90、Primer91各0.5 μL，模板DNA 2.5 μL，ddH2O 9 μL混匀后瞬时离心。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；93 ℃变性1 min、58 ℃退火1 min、72 ℃延伸3 min，33个循环；72 ℃延伸10 min。扩增产物经胶回收、克隆、测序与分析。

副结核分枝杆菌的亚型鉴定亚型鉴定的特异性引物来源于文献[3]， DMC529：TTGACAACGTCATTGAGAATCC； DMC531：TCTTATCGGACTTCTTCTGGC；DMC533：CGGATTGACCTGCGTTTCAC。Ⅱ亚型分型扩增片段310 bp，Ⅰ亚型分型扩增片段146 bp。

PCR反应体系(25 μL)：Go Tap Green Master Mix12.5 μL，引物Primer90、Primer91各0.5 μL，模板DNA 2.5 μL，ddH2O 9 μL混匀后瞬时离心。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸 30 s，30 个循环；72 ℃延伸 7 min。扩增产物经胶回收、克隆、测序与分析。

2 结 果

2.1细菌学检查 萋-尼氏法抗酸性染色镜检在被检样品中存在抗酸染色阳性的杆状菌体(红色)，见图1。

2.2病理组织学检查 4%多聚甲醛溶液固定的回肠组织作常规病理组织学切片、萋-尼氏法抗酸性染色，镜检观察可见回肠粘膜下层抗酸染色阳性区域(红色)，见图2。

图2 小肠病理组织切片抗酸性染色(10×40)Fig.2 Anti-acid staining of pathological tissues lice of small intestine(10×100)

2.3PCR扩增 34T-44、34T-45样品经提取总DNA，用副结核分枝杆菌IS900分子鉴定引物作PCR扩增，电泳得到400bp大小的片段，与预期的目的片段大小相符(图2)。

注：M：DNA Marker DL2000；1：空白对照；2：34T-44 PCR扩增片段.3: 34T-45 PCR扩增片段图3 副结核分枝杆菌IS900基因PCR鉴定Fig.3 Identification of IS900 gene PCR amplification of M. avium subsp. paraenberculosis

对34T-44、34T-45样品采用DMC529、DMC531、DMC533亚型分型引物作PCR扩增，得到310 bp大小的片段，与Ⅱ型分型基因片段的预期大小一致(图3)。

注：M：DNA Marker DL2000；1：空白对照；2：34T-44 PCR扩增片段.3: 34T-45 PCR扩增片段图4 副结核分枝杆菌亚型PCR鉴定Fig.4 Subtype identification of M. avium subsp. paraenberculosis by PCR

2.4IS900基因核苷酸同源性比较及系统进化树构建 应用DNAstar软件，34T-44、34T-45序列与副结核分枝杆菌参考序列进行IS900基因核苷酸同源性比较(见表1)。结果显示，34T-44、34T-45与参考株同源性均在99%以上。34T-44、34T-45两者之间同源性为100%。从而确定34T-44、34T-45样品为副结核分枝杆菌。

表1 34T-44、34T-45与参考株IS900基因核苷酸同源性比较
Tab.1 Nucleotide sequence alignment ofIS900 gene of different strains

根据副结核分枝杆菌IS900基因序列核苷酸同源性比较分析，构建遗传进化树，如图4所示。34T-44、34T-45与FJ775181.1(21P,西班牙/2009，绵羊，Ⅰ型)、KJ173784.1(AHRI-4，埃及/2014，奶牛)、AF305073.1(ATCC 53950，新西兰/2000，牛)、FJ775182.1(CAM 86，西班牙/2009，山羊, III型)、CP022095.1(FDAARGOS_305，美国/1990，奶牛，粪便)、CP022105.1(JII-1961德国/2003，奶牛，II型)、KT075353.1(LAV4，伊朗/2015，人血液)、KY012364.1(MAPIS900VPH12016，印度/2015，水牛，牛奶)在遗传进化上具有高度的亲缘性。

图5 基于副结核分枝杆菌IS900基因的系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree analysis of IS900 gene of M. avium subsp. paraenberculosis

2.5基于副结核分枝杆菌亚型的鉴定以副结核分枝杆菌分型引物DMC529、DMC531、DMC533作PCR检测，34T-44、34T-45样品的测序序列与Desmond M. Collins[3]研究结果中牛型、羊型副结核分枝杆菌序列核苷酸比较(见图6)，图中DMC531/DMC533特异性亚型分型引物扩增的是Ⅱ型(牛型)副结核分枝杆菌，DMC529/DMC533特异性亚型分型引物扩增的是Ⅰ型(羊型)副结核分枝杆菌；Sheep株4～21nt核苷酸与Cattle株、34T-44、34T-45样品相对应的核苷酸存在明显差异，同时sheep株存在一个12 bp串联重复序列和中间4 bp连接序列共同形成的回文序列，这是cattle株所不具有的；34T-44、34T-45与Cattle株序列同源性达到99.0%以上，而与sheep株同源性只有49%，结果表明34T-44、34T-45样品为Ⅱ型(牛型)副结核分枝杆菌。

注：黑色框分别表示DMC531、DMC529、DMC533引物序列及扩增方向。阴影部分代表参考株与待检序列存在的差异。下划线代表sheep株12 bp串联重复序列和中间4 bp连接序列共同形成的回文序列。图6 Ⅰ型(羊型)与Ⅱ型(牛型)副结核分枝杆菌核苷酸序列比较Fig.6 Sequence alignment of sheep subtype and cattle subtype of M. avium subsp. paraenberculosis

3 讨 论

根据副结核分枝杆菌插入序列IS900分子的PCR鉴定、亚型鉴定分析，结合患病马鹿的临床症状、病理变化、组织抗酸性染色，确定本研究中的马鹿所感染的是Ⅱ型(牛型)副结核分枝杆菌。

目前，副结核病呈世界性流行，养牛发达国家，如部分欧美国家，澳大利亚、新西兰等尤为多见。我国在1975年由吉林农业大学韩有库等分离出此菌[4]。我国部分地区牛群副结核分枝杆菌感染率较高[5]。马鹿是副结核病的易感宿主，在国内，多位学者[6-8]开展了马鹿副结核病的研究报道，新疆亦有马鹿副结核病的报道[9-12]。

马鹿副结核病除常规的临床诊断外，确诊依赖于实验室诊断方法。马鹿感染副结核分枝杆菌到表现出临床症状通常为12个月或更长时间[13]。亚临床状态的马鹿缺乏典型症状，甚至感染的马鹿临床表现为健康，因此，仅凭临床症状难以作出准确的判断。副结核分枝杆菌属于慢生长种，初代分离极为困难[4]，分子生物学技术的应用为副结核分枝杆菌种、亚型的准确、快速鉴定提供了可能。IS900 为副结核分枝杆菌的一段特异性很高的插入序列[14]，其拷贝数高达20个，存在于副结核分枝杆菌，常作为副结核分枝杆菌PCR检测基因并用于种的鉴定。但有些分枝杆菌也存在IS900序列[15]，因此，以IS900检测基因作PCR诊断时，应特别注意结果分析。

从细菌学分类上，副结核分枝杆菌可分为3个亚型：Ⅰ型(羊型)、Ⅱ型(牛型)以及Ⅲ型(生物中间型)，亚型不同其培养特征也各有差异[5]。由于体外培养时间长、培养难度较大，难获得分离菌，为该菌的亚型分型带来了一定的难度。根据Collins 的方法[3]，采用DMC引物作PCR分型可有效地鉴定副结核分枝杆菌亚型，这方法主要是根据牛型、羊型基因序列之间存在的差异性，羊型有一个12 bp串联重复序列和中间4 bp连接序列共同形成的回文序列，而这种序列差异性成为副结核分枝杆菌亚型分型的关键。

副结核病的潜伏期长，感染后不易被发觉，同时，患畜长期向体外大量排菌，传染性强，而易感动物最常见的感染途径是消化道，通过摄入环境中粪便污染物而感染副结核分枝杆菌。严重感染鹿群所繁殖的马鹿或同群其它马鹿受到感染而变成永久性的带菌者，因此，该病很难净化。马鹿是副结核病的易感宿主，34T-44、34T-45马鹿感染的为Ⅱ型(牛型)副结核分枝杆菌。据调查患病马鹿所在的鹿场，马鹿主要是驯化饲养为主，其周边有牛场、羊场的分布。该鹿场驯化饲养前就已感染携带成为隐形或显性宿主，或者是副结核分枝杆菌的储存库，还是由于外界因素传入该鹿场，还需做深入地调查研究。

目前，针对副结核病尚无有效药物和疫苗，采取全群检查、剔除患畜、分群、持续监测以及加强消毒工作等方法是目前防控副结核病的主要手段，同时，结合马鹿副结核病流行率变化情况，制定有相应的防控策略、净化策略，以降低鹿群中副结核病的发展趋势。因此加强对实验室诊断研究、流行病学调查对其综合防控具有十分重要的意义。

本研究在传统诊断方法的基础上，采用PCR进行快速检测、亚型分型，提高了鉴定的准确性，为进一步开展马鹿副结核病病原学研究、流行病学调查、防控措施的制定提供了重要的参考依据。

利益冲突：无