结核分枝杆菌Rv3425-Rv1168c蛋白融合表达与血清学评价

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结核病是由结核分枝杆菌 (Mycobacteriumtuberculosis, MTB) 引起的一种传染性强的慢性传染病，尤其在人口密集地方以及其他传染疾病如艾滋病等并发感染已经呈上升的趋势[1]。结核分枝杆菌作为一类人兽共患病病原体能够感染多种宿主，并经多种途径和方式传播，在人体多个器官都能形成感染病灶，引发肺结核、肾结核、皮肤结核等，而且感染早期诊断往往由于病症表现不明显而造成误诊[2-4]。对结核病的快速诊断和合理治疗是有效控制结核传染的关键[5]，目前结核病的临床检测大都具有明显的缺点，如耗时长、特异性差和敏感性低等。利用特异性抗原的结核病血清学快速诊断具有特异性高和敏感性强的特点，有望成为结核病临床诊断首选方法，而从结核菌基因组蛋白中寻找敏感性和特异性强的抗原蛋白则是进行血清学诊断的基础。Rv3425、Rv1168c蛋白均属于PPE蛋白家族，特点是富含甘氨酸且为结核分枝杆菌所特有，其N端附近序列为Pro-Pro-Glu结构域。Rv3425属结核菌RDII区，仅仅存在于致病性分枝杆菌中，该蛋白为免疫显性的B细胞目标抗原，能够用于鉴别肺结核和肺外结核，在临床检测等应用上具有一定价值[6-7]。Rv1168c蛋白具有很强的保守性，亦属于结核分枝杆菌特有。Rv1168c蛋白在结核分枝杆菌携带者体内能激发特异的细胞免疫反应，对感染者具有免疫保护性[8-9]。本研究参照以往的工作基础，通过以结核分枝杆菌H37Rv的基因组为模板，采用重叠PCR方法扩增Rv3425-Rv1168c核酸序列并进行原核表达与纯化，并且通过血清学评价重组蛋白进行临床诊断的可行性，为研制更为有效的结核病免疫诊断试剂以及新型疫苗和新型药物研究打下基础。

1 材料与方法

1.1材料 原核表达质粒pET-24b、结核分枝杆菌H37Rv基因组、表达菌种BL21(DE3)均由本实验室保存；质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购于OMEGA(美国)；限制性内切酶、T4 DNA连接酶、TaqDNA聚合酶和dNTP均购于NEB公司；临床确诊结核患者血清由结核病研究所临床检验室提供；非结核呼吸疾病患者血清来自本院呼吸科住院病人；健康人血清来自本院体检中心；引物合成与测序均由北京华大基因公司完成；酶标羊抗人IgG(HRP)购自索莱宝生物工程技术公司；亲和色谱填料购自GE公司；其他生化试剂均为国产分析纯。

1.2 方 法

1.2.1引物设计 根据结核分枝杆菌Rv3425、Rv1168c基因序列，设计合成了重叠PCR特异性引物，在Rv3425 N端引物5′ 端引入限制性内切酶NdeⅠ位点，在Rv1168c C端引物3′端引入限制性内切酶XhoⅠ酶切位点。终止密码子为原核偏好密码子TAA。引物设计如下：

P1: 5′-GGATCCCATATGCATCCAATGATACCAGCGGAG-3′；

P2: 5′-CTACAGGGGCGGGGGTGGAGGTGGA-AGTGCGAACGCCTGGAAG -3′；

P3: 5′-CTTCCAGGCGTTCGCACTTCCACCTCCACCCCCGCCCCTGTAG -3′；

P4: 5′-TATGGAGCTCTTACCGCAGTATCAC-TCCG-3′

1.2.2Rv3425-Rv1168c重组质粒的构建与表达 以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板，分别用引物P1与P3，P2与P4扩增Rv3425与Rv1168c核酸序列，将扩增所得的两段PCR产物混合，1∶100进行稀释后作为模板，用引物P1与P4进行扩增获得Rv3425-Rv1168c全核酸序列。重叠PCR产物和质粒载体pET-24b均以NdeⅠ和XhoⅠ进行双酶切，然后在T4DNA连接酶的作用下，将Rv3425-Rv1168c表达序列克隆到表达质粒pET-24b中，筛选测序正确的质粒进行保存。取重组工程菌活化后接种于含卡那霉素的LB培养基中，37 ℃条件下震荡培养，在菌液OD600达到约0.4后，加入IPTG至终浓度为0.4 mmol/L，在37 ℃，200 r/min条件下继续震荡诱导表达7 h。离心收集菌体，低温条件下进行超声破碎，12%SDS-PAGE分析目的蛋白Rv3425-Rv1168c的表达水平和存在形式。

1.2.3Rv3425-Rv1168c蛋白复性、纯化 Rv3425-Rv1168c蛋白主要以包涵体的表达形式存在。将包涵体用1%的Triton-X 100洗涤两次，包涵体用8 mol/L尿素和PBS缓冲液充分变性溶解，高速离心收集上清。上清液进行柱上复性，4 ℃条件下取上清过镍离子亲和柱，以PBS缓冲液缓慢洗涤，然后分别以50 mmol/L、150 mmol/L咪唑洗脱杂蛋白和目的融合蛋白，SDS-PAGE分析目的蛋白的纯度。对纯化目的融合蛋白进行水透析后以冰干保存。

1.2.4Rv3425-Rv1168c蛋白免疫印迹与ELISA分析 纯化Rv3425-Rv1168c蛋白经SDS-PAGE电泳后通过半干法转到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，洗涤后以3例强阳性人血清和6例健康人血清分别震荡孵育30 min，HRP标记的羊抗人IgG孵育1 h后，震荡洗涤5次，ECL暗室自动曝光显影分析Rv3425-Rv1168c蛋白的抗原特异性。

以0.05 mmol/L碳酸钠将Rv3425-Rv1168c重组蛋白稀释至3 μg/mL，包被过夜后，37 ℃封闭2 h，PBST洗板4次；3%BSA于4 ℃封闭过夜，洗板5次，分别用临床确诊的100份临床确诊结核患者血清、20例非结核呼吸疾病患者血清和100份健康人血清(血清稀释度为1∶50)37 ℃孵育1 h，重新洗板若干次，每孔中加入用PBS稀释成1∶1 000的HRP标记的羊抗人IgG 100 μL，于37 ℃温箱放置1 h，洗板5次，加TMB显色液置于37 ℃温箱中反应30 min显色，终止反应。酶标仪检测D450nm波长处的A值，阳性结果判定以cut-off值为健康人血清检测平均A值+3倍标准差。

2 结 果

2.1Rv3425-Rv1168c融合表达载体的构建 通过PCR方法获得的Rv3425与Rv1168c核酸序列后再采用重叠PCR的方法获得Rv3425-Rv1168c核酸全序列，取少量PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示，在目的分子量530 bp、970 bp、1 518 bp处分别有清晰的Rv3425、Rv1168c以及Rv3425-Rv1168c条带。双酶切重叠PCR产物，克隆到载体pET-24b 中，转化至感受态 BL(DE3) 细胞。

M. DL2000；1. Rv3425核酸片段；2. Rv1168c核酸片段；3. Rv3425-Rv1168c核酸片段图1 Rv3425-Rv1168c核酸序列PCR凝胶电泳鉴定结果Fig.1 Gel electrophoresis identification results of PCR products of Rv3425-Rv1168c nucleic acid fragment

2.2Rv3425-Rv1168c融合蛋白原核表达分析 将工程菌接种含卡那霉素的LB培养基中扩大培养，经IPTG诱导后，低温条件下对菌体超声破碎，SDS-PAGE电泳结果显示(图2)，在目的分子量55 kD处，Rv3425-Rv1168c获得较高表达，但主要以包涵体的形式存在，融合蛋白的表达量占细菌总蛋白的30%左右。

M.低分子量蛋白标准；1.未诱导的全菌体蛋白；2.经IPTG诱导的全菌体蛋白；3.超声上清；4.超声沉淀图2 pET-24b-Rv3425-Rv1168c原核表达产物SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of prokaryotic expression products of pET-24b-Rv3425-Rv1168c

2.3Rv3425-Rv1168c融合蛋白包涵体复性与纯化 Rv3425-Rv1168c包涵体经过初步提纯，在8 mol/L尿素与PBS缓冲液的变性条件下进行亲和纯化，分别以50 mmol/L、150 mmol/L咪唑洗脱杂蛋白和目的融合蛋白，通过SDS-PAGE分析发现(如图3所示)，纯化后的融合蛋白纯度可达到90%以上，对纯化的蛋白按1∶1的比例水透析6次后冰干保存。

M.低分子量蛋白标准；1.上样前；2. 50 mmol/L咪唑洗脱峰；3. 150 mmol/L咪唑洗脱峰图3 Rv3425-Rv1168c融合蛋白亲和纯化SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of the affinity purification products of Rv3425-Rv1168c fusion protein

2.4Rv3425-Rv1168c融合蛋白Western Blot与ELISA分析 纯化后的Rv3425-Rv1168c融合蛋白经SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上，分批次经3例强阳性人血清和6例健康人血清孵育、HRP标记羊抗人二抗结合反应，Western Blot结果见图4。结果表明，纯化后的Rv3425-Rv1168c融合蛋白能与3例确诊结核病人血清抗体结合，而与健康人对照血清标本不反应，显示重组融合蛋白具有较强的抗原性和特异性。

图4 Rv3425-Rv1168c与不同人阳性血清Western Blot结果Fig.4 Western blot results of the reactions of Rv3425-Rv1168cfusion protein with 3 TB patient sera

分别以100份临床确诊结核患者血清、20例非结核呼吸疾病患者血清和100份健康人血清与Rv3425-Rv1168c融合蛋白进行ELISA检测实验，结果如图5所示，其中设定cut-off值为健康人血清检测平均A值+3倍标准差。

图5 重组Rv3425-Rv1168c蛋白与不同人血清ELISA结果Fig.5 ELISA results of the reactions of Rv3425-Rv1168c fusion protein with sera of TB patients, non-tuberculous patients and healthy people

统计实验结果为临床确诊结核患者血清阳性检出例数为54例，检出阳性率为54%；非结核呼吸疾病患者血清检出1例，检出率为5%；健康人血清检出2例，检出率为2%，特异度为95%。ELISA结果说明，获得的重组融合蛋白Rv3425-Rv1168c在进行结核病血清学检测上具有可观的敏感性和特异性，可用于结核病人的血清学诊断。

3 讨 论

造成结核病误诊率和漏诊率高的一个很重要的原因就是对结核分枝杆菌的感染缺乏快捷、灵敏的检测方法。目前，临床上主要采用的结核病检测方法包括抗酸染色、结核菌培养、血清学检测、芯片检测等[10-13]。其中，血清学诊断由于具有操作简单、稳定性强等特点，是诊断结核病的主要研究方向之一。然而，由于血清学诊断对于检测抗原的免疫原性和特异性都有较高的要求，因而在实际操作中也存在一定的局限性，例如敏感度较低、特异性差等。因此研究者一直在寻找结核分枝杆菌特异性强的抗原去用于结核病的血清学诊断的研究。PPE蛋白家族占有结核分枝杆菌全基因10%的开放阅读框(ORFs)，它们在序列和结构上的特异性在开发新型特异性诊断抗原或者结核疫苗的方面可能具有一定优势[14]。结核分枝杆菌Rv3425、Rv1168c蛋白都是PPE家族成员，它们除了共有PPE结构域外，没有其它的共同作用位点，因此不会产生抗原抗体的交叉反应，而且表现出较强的免疫活性，能将结核病患者与BCG接种者区别开[15]。

目前针对结核病的实验室诊断中，还没有一种特异抗原能够在结核患者血清学检测中获得令人满意的结果，本实验室前期工作分别将Rv3425蛋白与Rv1168c蛋白进行表达和纯化，在进行大量临床样本进行血清学验证时，敏感度分别为45%和51%，特异性均可达到97%以上，虽然在临床血清学验证中取得了较好结果，但敏感性还达不到临床实验室检测的要求[16-17]。通过多个特异抗原的融合串联重组可以提高抗原的敏感性，在本实验中我们将Rv3425蛋白与Rv1168c蛋白进行融合表达和纯化，并采用western-blot和ELISA实验来验证融合蛋白的特异性和敏感性。从实验结果看，纯化后的Rv3425-Rv1168c融合蛋白血清学敏感度能够达到54%，特异度为95%，相对单个Rv3425蛋白或者Rv1168c蛋白，敏感性存在一定程度提高。但融合抗原与非结核呼吸疾病患者血清也存在部分交叉反应，其原因可能是融合抗原序列中含有较多的非保守序列，降低了特异性，因此该融合抗原的敏感性和特异性仍后期需扩大样本量进行重复验证。本次实验获得的融合抗原相对其它结核菌抗原具有较为明显的优势，这与我们预期的实验结果基本吻合。此次实验结果提示Rv3425-Rv1168c融合蛋白能够作为结核病诊断的潜在检测抗原，该结果为后期的结核病免疫诊断试剂的研制和开发打下基础。

利益冲突：无