114例HIV/MTB双重感染病例结核分枝杆菌Spoligotyping基因分型研究

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目前，结核病仍是世界十大死因之一。根据2016年全球结核病报告，据估计2015 年全世界新发结核病数量约为1 040万例，其中男性590万(占56%)，女性350万(占 34%)，儿童100万(占 10%)。120万新发结核病例为艾滋病毒感染者(占 11%)，超过95%的结核病死亡发生在低收入和中等收入国家[1]。分子流行病学是研究结核病传播的有效手段，与传统的流行病学研究相比，能够更准确地预测疾病的传播模式及其暴发流行模式，发现现有病例、新病例、特定传播环境间的关系以及更易检测出不同辖区病人间的传播[2]。

目前，常用于结核分枝杆菌基因分型的方法有很多，主要包括间隔区寡核苷酸分型(Spacer oligonucleotide typing，Spoligotyping)、多位点可变数目串联重复序列分析(Mycobacterial Interspersed Repetitive Units-Variable Number of Tandem Repeats，MIRU-VNTR)及插人序列6110(IS6110)限制性片段多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)等[3]。Kamerbeek 等设计的Spoligotyping技术，是一种独特的PCR方法，它扩增和标记直接重复(Direct Repeat，DR)区域的全部DNA间隔序列，使扩增后的 DNA与合成的寡核苷酸DNA序列探针杂交，然后根据杂交反应结果进行基因分型。该方法快速、简便、重复性高，适合用于临床标本，无须培养，是目前使用最频繁的结核分枝杆菌 PCR 分型方法[4-5]。而且特别适用于IS6110 拷贝数少于5个的结核菌分离株的分子分型，适用于结核病暴发流行时确定出传染源病例，确定实验室交叉污染及实验室或院内感染结核分枝杆菌菌株分布及优势株等方面的研究[6-7]。

本研究采用Spoligotyping技术对采集的114例HIV/MTB双重感染病例结核分枝杆菌进行基因分型研究，了解HIV/MTB双重感染人群中结核分枝杆菌的基因型及其流行情况，对比其与单纯感染MTB的结核分枝杆菌基因分型是否一致，探讨其在今后HIV/MTB双重感染病例中结核病控制中的应用价值。

1 材料与方法

1.1样本来源 2014年至2016年，从江西省胸科医院、南昌市第九医院、南昌大学第一附属医院及广州市第八人民医院和云南省传染病专科医院共收集到诊断为 HIV/MTB 双重感染114例住院患者结核菌样本(镜检和培养均为阳性)。其中，江西省30例、广东省48例、云南省36例。

1.2试剂及菌株 颇尔尼龙转印膜购自上海必泰生物科技有限公司，ECL免疫印迹底物购自赛默飞公司，streptaridin-POD conjugate和CDP-star 检测液购自德国罗氏公司，EDAC、SSPE、NaHCO3、NaOH、SDS、EDTA等购自生工生物公司、定影液和显影液等购自锐珂医疗器材公司，43条探针引物由生工公司合成，序列见参考文献[8]。结核分枝杆菌 H37RV 标准菌株来自中国疾病预防控制中心。

1.3DNA的提取 将一菌环培养基上生长良好的结核分枝杆菌溶于400 μL TE 缓冲液中，沸水浴10 min，12 000 r/min 离心10 min，上清即为DNA 模板，-20 ℃冰箱保存备用。

1.4Spoligotyping分型 采用Kamerbeek 等推荐的Spoligotyping标准方法进行基因分型[4]。

1.4.1带探针膜的制备 室温下用新鲜配制的16% EDAC在塑料容器里震荡孵育Biodyne C膜15 min使膜活化，后用150 μL 0.5 mol/L NaHCO3稀释寡核苷酸探针至终浓度为0.125 μmol/L，将稀释好的探针依次加入到膜中孵育。最后用2×SSPE/0.1% SDS洗膜后保存备用。

1.4.2PCR扩增 用一对引物扩增整个DR区。引物的序列为DRa：5′-GGTTTTGGGTCTGAC-GAC-3′，DRb：5′-CCGAGAGGGGACGGAAAC-3′。DRa引物5′端进行生物素标记。35 μL PCR反应就体系：Mix 18 μL，H2O 10 μL，DRa 2 μL，DRb 2 μL，DNA 3 μL。PCR 反应条件：96 ℃ 3 min，之后96 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，35个循环，最后72 ℃延伸6 min。

1.4.3杂交与监测 用150 μL 2×SSPE/0.1% SDS 稀释PCR产物，100 ℃金属浴后加到固定有探针的Biodyne C膜杂交1 h。洗膜后通过链霉亲和素-过氧化物酶连接体streptaridin-POD conjugate孵育及CDP-star检测液的检测，最后用胶片曝光获取结果。

1.4.4结果分析 将分型结果转换后提交到数据库平台中进行比对分析http://www.miru-vntrplus.org，确定菌株的基因家族。

2 结 果

2.1菌株分析 114例HIV/MTB双重感染病例结核分枝杆菌来自3个省份(按籍贯分包括广东、江西、云南、湖北、湖南、贵州、重庆、山东、广西和新疆)，其中6例流调资料不详。剩下的108例病例中，包括男性96人，女性12人；年龄在20～30之间的20人，31～40之间的42人，41～50之间的25人，51～60之间的16人，60岁以上的5人(图1)。婚姻情况以已婚为主，占65.7%(71/108)，感染HIV和MTB顺序多数为先感染HIV后感染MTB，占94.4%(102/108)。

图1 HIV/MTB双重感染病例年龄构成Fig.1 Age composition of HIV/MTB co-infection patients

2.2基因分型情况 根据Spoligotyping图谱构建

UPGMA进化树，见图2。聚类分析显示，114例HIV/MTB双重感染病例结核分枝杆菌成2个大的基因家族，即北京家族(Beijing Family)和非北京家族(non-Beijing Family)，分别占66.7%(76/114)和33.3%(38/114)，共30种基因型(表1)。其中，典型的北京家族基因型包含74个菌株，表现为仅与35-43之间的9个间隔区呈阳性杂交反应；另有2个菌株呈北京样基因型，表现为35-43之间出现1个位点的阴性反应。此外，在HIV/MTB双重感染病例结核分枝杆菌菌群中还存在T家族共18株(包含4种T1家族共11株、2种T2家族共2株、1种T2-T3家族1株，1种T3家族共3株和1种T4家族1株)，H家族共5株(主要为4种H3家族)，EAI5基因家族1株和CAS1_DEHLI基因家族1株。此外还存在12种基因型在数据库中没有对应基因家族或没有匹配的结果。北京家族菌株和非北京家族菌株在性别和年龄组成方面差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表1 114例HIV/MTB双重感染病例结核分枝杆菌Spoligotyping分型结果
Tab.1 Spoligotyping results ofMycobacteriumtuberculosisin 114 cases of HIV/MTB co-infection patients

Spoligotyping图谱基因家族SIT号菌株数□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■■■■■Beijing174□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■□■■■Beijing1901□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■□■■■■Beijing2551■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■T1537■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□■□□□□■■■■■■■H3502■■■■■■■■■■■■■■■■■■□■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■T4401■■■■■■■■■■■□□■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■T110731■■■■■■■■■■■■□■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■T3373■■■■■■■■■■■■□□■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■T11311■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■□■■■T2521■■■■■■■■■■■■■■■■■■□■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■□■■■T210771■■■■■■■■■■■■□■■■■■□■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■□■■■T2-T35031■■■■■■■■■■■■■■□■■■■■■■■■■■■■■■□■□□□□■■■■■■■H3751■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□■□□□□■■■■■■■H319081■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■□■■■■■■■■■EAI52361■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□■□□□□■■■■■■■H35111■■■■■■■■■■■□■□□□□□□□□□□□■■■■■■■■□□□□■■■■■■■T12492□■■□□□□■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□□□□□□□■■■■■■■■■CAS1_DEHLI4711■■■■■■■■■■■□■■□□□□□□□□□□■■■■■■■■□□□□■■■■■■■New1■■■■■■■■■■■■■■□■■■■■■■■■■■□□□□□■□□■■■■■■■■■New1■□■■■■■■■■□□■■■■■□■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■New2■■■□■■■□□□□■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■□■■■■■■■■■New1■■■■■■■■■■■■■■□■■■■□□■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■■■New1■■■■■■■■□□□■□□■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■New1■□■■□■■□■□□□■□□■■■■■□□■■■■■■■■□■□□■■■■■■■■■New1■□■■□□■□■■■□□■□■■■■■□■■■■■■■■■□■□□■■■■■■■■■New1■□■■■■□□■■■■□□□■□■□■□■■■■■□■■■□□□□■■■■■■■■■New1■□■■■■■□■□■□■□□■■■□■□■■■■■□■■■□■□□■■■■■■■■■New1■□■■■■■■■■■■■■□■■■■■■□□□□□□□□□□■□□□□■■■■■■■New1■■■■■■■■■■■□■□□■□■■■□■□□■□□■■■■■□□■■■■■■■■■New1

表2 114例HIV/MTB双重感染病例结核分枝杆菌在性别和年龄构成方面差异
Tab.2 Differences in sex and age composition ofMycobacteriumtuberculosisin 114 cases of HIV/MTB co-infection patients

人数北京家族非北京家族χ2P值性别男966630女12661.6880.194年龄20-302017331-4042251741-502517851-6016115>605235.6410.228无病例资料642

从左到右以此为：进化树、菌株编号、SpolDB4数据中的SIT号、基因家族、Spoligotyping图谱图2 HIV/MTB双重感染病例结核分枝杆菌UPGMA进化树Fig.2 UPGMA-tree of the genotypes of Mycobacterium tuberculosis in HIV/MTB co-infection patients

3 讨 论

本研究采用间隔寡核苷酸分型(Spoligotyping)技术对所收集的114例HIV/MTB双重感染病例结核分枝杆菌临床分离株进行了基因分型研究。结果显示，114例结核分枝杆菌成2个大的基因家族，即北京家族(Beijing Family)和非北京家族(non-Beijing Family)，其中以北京家族菌株为主，占到66.7%。据报道，浙江(北京家族占70.0%/71.4%)[2-3]、新疆(北京家族占68.7%)、吉林(北京家族占89.5%)[7]、广西(北京家族占55.3%)[8]、甘肃(北京家族占86.9%/87.6%)[9-10]、四川(北京家族占61.3%)[11]、北京(北京家族占85.1%)[12]、黑龙江(北京家族占89.5%)[13]、江苏(北京家族占80.4%/81.1%)[14-15]、内蒙古(北京家族占85.5%)[16]、上海(北京家族占80.3%)[16]、山东(北京家族占85.9%)[17]、武汉(北京家族占81.9%)[18]、西藏(北京家族占90.6%)[19]、香港(北京家族占68.5%)[20]、重庆(北京家族占75.0%/66.7%)[21-22]、江西(北京家族占75.9%)[23]等全国多省市结核分枝杆菌基因分型也是以北京家族为主。另有研究对全国部分省份的结核分枝杆菌临床分离株进行Spoligotyping基因分型，结果也显示北京家族基因型为主要我国流行基因型[24-25]。本研究与单纯感染MTB的流行菌株一致，均为北京家族菌株。北京家族菌株是由Van等在1995年首次报道的，它们具有特征性的spoligotyping指纹图谱，即1-34间隔区缺失。目前，已经在世界范围内发现了北京家族菌株的流行[26]。有研究指出，北京家族的产生可能是由于长期的卡介苗(BCG)接种和大量抗菌药物使用的选择性压力造成，并且成功传播[7-8]。另据 SITVIT2 数据库统计结果显示，全球约有1/3的结核病都是由北京家族菌株引起的，而在东亚，超过50%的结核分枝杆菌为北京家族菌株。本研究首次发现，在HIV/MTB双重感染人群中，结核分枝杆菌主要流行株仍然为北京家族菌株。这在制定HIV/MTB双重感染人群结核病的防控措施时，提示要重点加强对北京家族菌株的流行病学监测。此外，统计分析显示，在HIV/MTB双重感染病例菌群中，北京家族菌株和非北京家族菌株在性别和年龄组成方面差异无统计学意义(P>0.05)，因此，导致北京家族菌株流行的因素还有待进一步研究。

此外，在HIV/MTB双重感染病例结核分枝杆菌基因型中，还发现有T家族(15.8%，18/114)，H家族(4.4%，5/114)，EAI5基因家族和CAS1_DEHLI基因家族(分别占0.1%，1/114)。T家族和H家族菌株是非洲、欧美地区的主要流行菌株，也是本研究中发现的第二、三大流行菌株，分别占15.8%和4.4%，它们分别来自广东、广西、云南、重庆、江西和湖南等省份，这也许与近年来我国与非洲、欧美地区旅游交流频繁有关系[27-28]。EAI5基因家族和CAS1_DEHLI基因家族主要流行于中东和印度等东南亚一些国家，近年来在中国新疆等省份也有发现[29-31]。本研究发现的该家族菌株均来自广东。此外，本研究还发现12种在数据库中没有对应基因家族或没有匹配的结果的菌株，提示在HIV/MTB双重感染病例结核分枝杆菌菌群中，可能存在新的突变基因型，但其具体分型和流行病学意义有待进一步研究。

本研究首次对HIV/MTB双重感染病例结核分枝杆菌基因型进行了初步的研究，发现北京家族菌株为HIV/MTB双重感染病例结核分枝杆菌菌群的主要流行菌株。同时还存在T家族、H家族、EAI5家族和CAS1_DEHLI家族菌株等其他家族的结核分枝杆菌。这对HIV/MTB双重感染人群结核病的流行趋势分析、防控措施制定等具有重要指导意义。

利益冲突：无