鸡绦虫寄生菌种的PCR鉴定及其进化关系分析

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鸡绦虫病是由扁形动物门绦虫纲戴文科赖利属的多种绦虫寄生于肉鸡、蛋鸡及多种家禽小肠中引起的一种寄生虫性疾病。据报道可感染鸡的赖利属绦虫已达200多种，其中最常见的为棘钩赖利绦虫、四角赖利绦虫和有轮赖利绦虫[1-2]。鸡感染绦虫表现为精神沉郁、食欲减退、生长发育受阻，并伴有贫血、顽固性肠炎和下痢等症状。被绦虫感染的病鸡肠壁增厚，上可见大量出血点和结核状结节[3]。除了对病鸡造成直接的损害，鸡绦虫自身还携带大量的病原性超寄生物，可造成病鸡的继发性感染，增加病鸡的死亡率。目前关于鸡绦虫病的研究主要集中在病原体种属鉴定和宿主应答方面，而对绦虫体内携带的超寄生物尤其是细菌和真菌种类知之甚少。

课题组前期收集了山西省鸡感染绦虫病例，并对分离的绦虫进行了种属鉴定，确定该绦虫种类为棘沟赖利绦虫[4]。在此基础上，本研究设计用于鉴定细菌、真菌种类的通用型引物，旨在扩增寄生于鸡棘沟赖利绦虫体内的细菌和真菌DNA序列并进行测序，通过与NCBI数据库中报道的相关序列进行BLAST比对，确定细菌和真菌的种类并进行系统进化关系分析，为山西省鸡绦虫病尤其是绦虫引发的继发性感染的防治提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1虫体 断颈处死绦虫感染病鸡，剖开病鸡肠道，收集寄生于肠道中的绦虫虫体。灭菌蒸馏水反复清洗虫体后冻存于-80 ℃冰箱中备用。

1.1.2主要试剂 细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)购于天根生化科技(北京)有限公司；真菌基因组DNA提取试剂盒(D2300)购于北京索莱宝科技有限公司；PCR产物纯化回收试剂盒(DR0203)购于杭州昊鑫生物公司；真菌、细菌通用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；PCR产物测序由上海美吉生物医药科技公司完成。

1.2 方 法

1.2.1PCR产物扩增 分别按照细菌和真菌基因组DNA抽提试剂盒操作说明提取绦虫中细菌和真菌基因组DNA。细菌鉴定采用16s rDNA通用引物(F：5′-GAGTTTGATCCTGGCTTAG-3′；R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行扩增。反应体系：30 μL；反应条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，共扩增40个循环。真菌鉴定采用18s rDNA通用引物序列(F：5′-TTAAGCCATGCATGTCTAAG-3′；R：5′-GACTACGACGGTATCTAATC-3′)进行PCR扩增。反应体系：30 μL；反应条件： 94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，共扩增38个循环。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.2.2目的基因序列测序 用DNA纯化回收试剂盒回收目的产物，将PCR产物片段连接到pEASY-T3载体上，导入感受态细胞中。对转化后的感受态细胞涂布于含Amp的LB培养板上进行筛选，挑取单个菌落在液体培养基中过夜生长，进行菌液PCR扩增。PCR扩增体系和条件同上，将菌液PCR结果为阳性的样品送测序公司测序。

1.2.3分子鉴定与系统发育树构建 将测序获得的靶基因序列在NCBI数据库中进行BLAST基因序列比对，从中选取相似性在95%以上的菌种序列，将所有选出的序列整理为fasta文本，使用MEGA5.1软件进行序列联配并构建系统发育树，分析靶基因序列与已知序列的基因进化关系。

2 结 果

2.116s rDNA基因扩增及进化关系分析 实验成功扩增出16s核糖体DNA(16s rDNA)目的序列，命名为SX-16s，产物长度为1 491 bp。将测序获得的16s rDNA序列在NCBI数据库16s rRNA(bacteria)中进行BLAST序列比对，根据比对结果，从中选取匹配度最高的，能反映不同种菌株16s rDNA特征的基因序列，在MEGA5.1中用邻接法构建系统发育树(图1)。

图1 16s rDNA基因序列系统进化树分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of 16s rDNA

表1 细菌16s rDNA序列BLAST比对结果
Tab.1 Sequence alignment results of bacteria 16s rDNA by BLAST

菌株名称NCBI序列号相似性Achromobacter spiritinusNR_117614.11470/1480 (99%)Achromobacter kerstersiiNR_152015.11466/1472 (99%)Achromobacter deleyiNR_152014.11466/1472 (99%)Achromobacter insuavisNR_117706.11463/1472 (99%)Achromobacter mucicolensNR_117613.11466/1479 (99%)Achromobacter pestiferNR_152016.11460/1472 (99%)Achromobacter aegrifaciensNR_117707.11459/1472 (99%)Achromobacter denitrificansNR_042021.11471/1491 (99%)Achromobacter piechaudiiNR_114102.11449/1456 (99%)Achromobacter xylosoxidansNR_044925.11455/1471 (99%)

图2 16s rDNA测序基因与GenBank数据库中无色杆菌(NR_117614.1)序列比对Fig.2 Sequence alignment of 16s rDNA with Achromobacter spiritinus (NR_117614.1) in GenBank

结果显示，实验扩增出的16s rDNA基因序列隶属于无色杆菌属(Achromobactersp.)，其对应菌株序列号为NR_117614.1、NR_152015.1、NR_152014.1、NR_117706.1、NR_117613.1、NR_152016.1、NR_117707.1、NR_042021.1、NR_114102.1和NR_044925.1，序列相似性均高达99%(表1)，其中与Achromobacter spiritinus (NR_117614.1)进化关系最近(图1、图2)。

2.218s rDNA基因扩增及进化关系分析 实验成功扩增出真菌18s rDNA目的基因，命名为SX-18s，产物长度为952 bp。琼脂糖凝胶电泳显示产物条带单一，大小与预期相符。将扩增出的18s rDNA基因进行测序，测序结果与NCBI数据库中已鉴定的真菌序列进行比对。根据比对结果，从中选取匹配度最高的，能反映不同种真菌 18s rDNA特征的基因序列，在MEGA5.1中用邻接法构建系统发育树(图3)，对应菌株序列号为：EU192367.1、EU192364.1、EU192362.1、LT671825.1、LT671817.1、DQ457640.1、KF706454.1、KF706456.1、KF706452.1、KF706453.1和KF706458.1(表2)。

表2 真菌18s rDNA序列BLAST比对结果
Tab.2 Sequence alignment results of fungus 18s rDNA by BLAST

菌株名称NCBI序列号相似性Malassezia restrictaEU192367.1762/766 (99%)Malassezia globosaEU192364.1740/754 (98%)Malassezia sp.EU192362.1740/754 (98%)Malassezia sympodialisLT671825.1925/959 (96%)Malassezia sympodialisLT671817.1925/959 (96%)Malassezia pachydermatisDQ457640.1920/959 (96%)Malassezia equineKF706454.1871/903 (96%)Malassezia capraeKF706456.1 869/903 (96%)Malassezia dermatisKF706452.1869/903 (96%)Malassezia nanaKF706453.1867/903 (96%)Malassezia japonicaKF706458.1858/905 (95%)

结果表明，实验扩增出的18s rDNA基因属于马拉色氏霉菌属(Malassezia)，其中与限制性马拉色菌(Malasseziarestricta)进化关系最接近，序列相似性为99%(图4)。 其它匹配菌株包括合轴马拉色菌(Malasseziasympodialis)、厚皮马拉色菌(Malasseziapachydermatis)、皮炎马拉色菌(Malasseziadermatis)、Malasseziaequina和Malasseziacaprae等，其中Malasseziaequine和Malasseziacaprae为近年新发现的菌株(表2、图3)。

图3 18s rDNA基因序列系统进化树分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of 18s rDNA

图4 18s rDNA测序基因与GenBank数据库中限制性马拉色菌(EU192367.1)序列比对Fig.4 Sequence alignment of 18s rDNA with Malassezia restricta (EU192367.1) in GenBank

3 讨 论

本研究检测到寄生于鸡绦虫体内的细菌和真菌主要属于无色杆菌属和马拉色氏霉菌属。无色杆菌是寄生于昆虫病原线虫肠道内的一种共生细菌，对线虫体内的共生菌起到主要的杀菌作用[5]。后来人们发现无色杆菌属细菌中的一些种类具有致病性。木糖氧化无色杆菌是无色杆菌属中一种非发酵的革兰氏阴性机会致病菌，主要侵袭免疫力较低的机体，也可引起各种组织和器官感染[6-7]。本研究从鸡绦虫体内检测到细菌DNA序列与糖氧化无色杆菌同源性达到99%，这提示鸡感染绦虫可能诱发机体发生无色杆菌诱发的继发性感染。马拉色菌是一种寄生于人和动物正常皮肤表面的真菌，可导致机会性感染，引起各种马拉色菌属相关疾病如花斑癣、毛囊炎及系统性感染等[8-9]。目前公布的马拉色菌属有14种[10]，其中限制性马拉色菌、厚皮马拉色菌、合轴马拉色、皮肤马拉色菌、Malasseziaequina、Malasseziacaprae、娜娜马拉色菌(Malassezianana)、日本马拉色菌(Malasseziajaponica)与本研究检测出的真菌同源性较高，表明鸡绦虫病存在间接传播马拉色菌属相关疾病的风险，这为鸡绦虫病尤其是鸡绦虫病诱发的继发性感染的防治提供了参考依据。

利益冲突：无