PERV病毒在异种移植中的感染风险及预防对策

张芸飞,李 鹏,黄利华,李汝红*,邢晓为*

(1.中南大学湘雅三医院医学实验中心,中国湖南长沙430013;2.昆明医科大学附属延安医院普外科,中国云南昆明650051)

供体短缺是器官移植中面临的一大难题,许多患者因无法及时得到供体而忍受痛苦甚至死亡。异种移植是解决器官移植短缺的有效手段之一。猪的繁育较快,其器官与人体器官在解剖结构和生理上具有较高的相似性,而且猪的疾病在种间传播有限且易控制,因而其作为器官移植供体来源已得到广泛认可,如猪胰岛细胞移植治疗1型糖尿病[1]、猪心脏移植治疗心脏病[2]等。异种移植应用于临床的阻碍除了异种间的免疫排斥反应之外,生物安全问题也值得高度关注。目前,α-1,3-半乳糖基转移酶基因敲除猪以及基因修饰猪的出现使异种移植克服了免疫排斥反应,取得了长足的进步[3～4]。另外,通过培育无特定病原体(specific pathogen-free,SPF)猪群可控制一些病原菌的传播[5]。然而,猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)以“前病毒DNA”的形式整合在猪的细胞基因组中,随细胞染色体的复制而复制,无法通过SPF培育消除[6]。

PERV是一种C型逆转录病毒,被认为是异种移植中微生物感染的主要风险之一[7]。研究发现,含有PERV的异种器官有感染人类细胞的潜在风险,可能引起人畜共患病[8]。因此,PERV种间传播的潜在风险成为了异种移植中人们关注的焦点问题。本文就PERV在异种移植中的感染风险及预防策略综述如下。

1 PERV的基本特征

1.1 PERV的分子结构

PERV由单股双链RNA构成,包括编码序列和非编码序列。非编码序列位于RNA的两端,包括5′端的R和U5区以及3′端的U3和R区。编码区由gag、pol和env 3个功能基因组成(图1)[9]。gag基因编码基质(matrix,MA)、衣壳(capsid,CA)和核衣壳(nucleocapsid,NC)的结构蛋白;pol基因编码蛋白酶(protease,PR)、逆转录酶(reverse transcriptase,RT)和整合酶(integrase,IN);env基因编码囊膜糖蛋白,主要包括表面蛋白SU(gp70)和跨膜蛋白TM(p15E)[10]。引物结合位点(primer-binding site,PBS)位于U5和gag之间,剪接供体(splice donor,SD)位于PBS序列的下游,随后是包装信号Ψ(psi)[11]。剪接受体(splice acceptor,SA)位点位于env和U3之间,多嘌呤管道(polypurine tract,PPT)位于其后。不同猪种的PERV拷贝数不同,中国小型猪的PERV可达4～96个拷贝[12]。

1.2 PERV的分型

gag基因和pol基因高度保守,env基因存在一定差异,其编码的囊膜糖蛋白结构不同,决定了病毒的特异性。基于此,人们将PERV分为PERVA、-B和-C 3个亚群。PERV-A和PERV-B为多噬性,能够感染几种人源细胞;PERV-C为亲噬性,仅感染猪源细胞。PERV-A和PERV-C可以形成PERV-A/C重组体,该重组体具有更高的复制效率[13]。

大量研究表明,PERV在不同的猪种之间的负载不平衡,不同猪种携带的PERV亚型有差异[14～18]。Fujimura等[14]对日本6个猪种进行检测,发现这些猪种均携带PERV-A和PERV-B,而PERV-C的携带率存在差异。Semaan等[15]对Göttingen小型猪携带的PERV进行研究,发现该猪种均存在PERV-A、-B和-C 3种亚型,但是未检测到PERV-A/C重组体。

本课题组对中国地方猪种进行了大量的调查研究,结果发现:所有猪种均携带PERV,但PERV在不同的猪种之间负载不平衡。有的猪种携带PERV-A、-B和-C 3种亚型,如:大围子猪、宁乡猪,其中宁乡猪中可检测到PERV-A/C重组体[16～17];而有的猪种主要携带PERV-A和PERV-B,如:沙子岭猪,我们检测了31头个体,其中29头个体PERV-C缺失[18]。在对中国地方猪种进行了大量的调查研究后,我们筛选到了合适的猪种进行培育,为临床选择合适的供体奠定了基础[19]。

2 PERV的检测方法

PERV的检测包括DNA和RNA的分析(PCR和RT-PCR)、PERV核酸水平的定量测定(实时PCR和实时RT-PCR)、逆转录酶活性测定(RT)以及病毒和受体蛋白检测(免疫学方法)[20]。

近年来,许多学者对传统PERV检测技术进行了改进,使其检出率大大提高[21～23]。Shah 等[21]将实时定量PCR与PERV-gag保守区序列捕获法结合以检测PERV,灵敏度可达每微克人DNA中检测 0.005～0.028拷贝,特异性可达 98.2%～100%。Moon等[22]利用基于双引物寡核苷酸(dual priming oligonucleotide,DPO)系统的多重PCR检测PERV亚型,可以同时增加几个靶标的检测特异性和灵敏性。Yang等[23]开发了一种基于磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles,MNPs)与化学发光(chemiluminescence,CL)的检测和分型方法,该方法快速、特异且具有很高的灵敏度,检出限为100 amol。该研究团队用该方法检测了巴马小型猪PERV亚型的相对拷贝数,发现该猪种PERV-C的拷贝数极低[24]。以上方法在筛选供体猪和检测人体是否有PERV感染中具有很好的应用价值,但其是否能够应用于临床还需更多的试验验证。

3 PERV的临床感染风险

由于PERV能够体外感染人类细胞,所以PERV的临床感染风险越来越成为异种移植中人们关注的重点问题。1997年,Patience等[8]报道PERV能够感染体外培养的人类细胞。随后,Laan等[25]在移植猪胰岛细胞的免疫缺陷小鼠中发现了PERV感染的证据。Martin等[26]将猪肾细胞PK15与不同原代人类细胞共培养,在人内皮细胞、血管成纤维细胞和肾小球系膜细胞中发现了PERV的存在,并且在PK15上清液培养的肾小球系膜细胞中也检测到了PERV。此外,相关研究已经证实,PERV能在体外感染外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)和胚肾细胞(HEK293)系[9,27～29]。刘金凤等[29]研究发现,PERV 体外感染的HEK293虽没有发生细胞病变,但其生长速度和细胞活力降低,推测PERV整合可能抑制了细胞的增殖。

尽管已有许多体外试验证实PERV能够感染人类细胞,但是目前尚没有人类异种移植感染PERV的报道[30]。Valdesgonzalez等[31]在23名猪胰岛细胞移植患者的白细胞中未检测到PERV DNA的存在,并且长期随访期间也没有发现PERV激活的证据。Morozov等[32]对8例接受猪胰岛细胞移植的患者进行了分析,也得到了同样的结论。Pitkin等[33]评估了接受体外生物人工肝治疗的28例患者的PERV感染情况,发现所有患者在治疗后5年内其外周血单个核细胞的PCR检测结果均为PERV阴性。我们课题组也对接受胰岛移植的病人进行过检测,未发现PERV在患者体内复制和感染[1]。

值得我们注意的是,上述患者没有使用免疫抑制剂或仅使用弱免疫抑制剂[30]。实际上,人体免疫系统对PERV具有很强的免疫力,一些限制性因子组成人体内先天免疫系统,在逆转录病毒复制的不同环节中发挥作用,如:APOBEC能够破坏病毒DNA的合成;TRIM5α能在病毒进入细胞后结合病毒衣壳蛋白,限制其脱壳;TRIM28可阻断病毒转录;锌指抗病毒蛋白(zinc-finger antiviral protein,ZAP)可诱导病毒RNA的降解;tetherin可以捕获被感染细胞表面的病毒颗粒,阻止病毒扩散[34]。当然,如果移植患者感染了HIV或服用了吗啡等阿片类药物,其机体APOBEC的表达将会受到抑制[35],此时移植病人还是存在PERV跨种系感染的风险。因此,在异种移植方面,PERV临床感染风险仍是世界卫生组织(World Health Organization,WHO)所关注的核心问题之一。

4 临床对PERV的预防策略

4.1 供体筛选

Lee等[36]发现,PERV-A/C重组体的感染性大约比PERV-A高500倍。Mourad等[37]发现,从出生到成年,猪胰岛细胞中PERV的拷贝数没有显著变化,但新生胰岛细胞中PERV的表达水平显著低于成年胰岛细胞。PERV在不同猪种之间的分布和负载不平衡,因此应选择低拷贝、低表达、PERV-C阴性的猪种作为供体,以减少病毒的传播。通过猪种筛选,可以找到PERV-C缺失的猪种作为候选供体。当然,所筛选的猪种还是有PERV-A和PERV-B,在临床应用中仍存在潜在的PERV感染风险。

4.2 供体细胞包被

Crossan等[38]将藻酸盐包被的PK15与HEK293和猪睾丸细胞共培养,未检测到PERV复制。叶征等[39]将新生猪胰岛细胞经微囊化后移植到狗体内,结果显示:微囊化的猪胰岛细胞能够在受体肝脏内存活并发挥作用,并且未发现PERV感染。这提示包被供体细胞可以有效阻止PERV的传播。但是,该技术必须确保包被材料的质量,若包被材料受损,PERV仍能穿过该屏障而感染人类细胞。

4.3 RNA干扰

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是与靶基因同源的双链RNA所诱导的一种特异性基因沉默现象,是一种抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。利用RNA干扰技术能够特异性剔除或关闭某些基因的表达。

目前已有许多团队利用RNA干扰技术成功抑制了 PERV 的表达[40～41]。Dieckhoff等[40]应用RNA干扰技术抑制猪成纤维细胞中PERV的表达,其抑制效率达到了94.8%。随后,该研究小组应用体细胞核转移技术制备了7头PERV低表达的转基因猪,检测发现这些转基因猪各器官PERV的表达被有效抑制。Li等[41]应用shRNA-pol3对中国实验性小型猪成纤维细胞PERV进行抑制,取得了较好的抑制效果,抑制后的PERV表达水平仅为野生型的7.9%。而且,将抑制了PERV的猪成纤维细胞与人HEK293细胞进行共培养,未检测到PERV跨种系传递。因此,RNA干扰技术也是预防PERV传播的一个有效方法,但是该方法不能从根本上消除PERV。

4.4 抗逆转录病毒药物

逆转录病毒通过逆转录酶将其RNA基因组逆转录为DNA,并通过整合酶将DNA稳定整合到细胞的基因组中。因此,抑制病毒逆转录酶和整合酶的活性可以抑制PERV的感染。

逆转录酶抑制剂主要包括核苷类逆转录酶抑制剂(nucleoside reverse transcriptase inhibitor,NRTI)和非核苷类逆转录酶抑制剂(non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor,NNRTI)两种。其中胸苷类似物叠氮胸苷(azidothymidine,AZT)抑制PERV逆转录酶的效果最好[42]。

常用的整合酶抑制剂有雷特格韦(Raltegravir)和度鲁特韦(Dolutegravir),已被美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准用于治疗HIV。研究发现,雷特格韦和度鲁特韦也能够有效地抑制PERV[43～44]。雷特格韦能够抑制PERV的复制和整合酶活性,其IC50在纳摩尔范围内[43]。有研究报道,雷特格韦和度鲁特韦的IC50分别为 8.634±0.336 nmol/L 和 3.06±0.844 nmol/L,而 AZT 的 IC50为 1.923±0.691 μmol/L[44]。因此,整合酶抑制剂是最有效的抗逆转录病毒药物。但抗逆转录病毒药物治疗PERV感染后是否会出现毒副作用、PERV是否具有耐药性等问题尚不清楚,因此不推荐使用抗逆转录病毒药物作为预防PERV的首选方法。

4.5 基因编辑

许多学者试图利用基因敲除技术从根本上消除PERV。CRISPR/Cas9基因编辑技术是继ZFN(zinc-finger nuclease)和TALEN(transcription activator-like effector nuclease)技术之后的第3代基因组编辑技术,由细菌和古细菌中存在的Ⅱ型系统经人工改造而成。因设计简便、可进行多基因编辑、编辑效率高,该技术成为国内外学者们的研究热点。

目前,已有学者成功应用CRISPR/Cas9技术对PERV进行了基因编辑。Yang等[45]利用该技术敲除了猪肾上皮细胞系(PK15)PERV pol基因的所有拷贝,使其感染人类细胞的能力降低了1 000倍。随后,Niu等[46]使用CRISPR/Cas9技术灭活了猪原代细胞系中的全部PERV拷贝,并通过体细胞核移植技术产生了世界上首批PERV敲除的猪,能够存活100 d,使人类从根本上消除PERV成为可能。然而,CRISPR/Cas9技术在敲除PERV基因方面并不成熟和完善。一方面,相关报道指出,在应用CRISPR/Cas9技术修饰基因组中的PERV基因后,所产生的基因修饰猪有一半在出生后不到4个月的时间就死亡[47],而且PERV基因的敲除对猪器官生理功能的影响目前尚不清楚。另一方面,CRISPR/Cas9技术仍存在一些缺陷亟待解决,如脱靶效应。Fu等[48]发现CRISPR/Cas9编辑的人细胞中出现了高频脱靶突变。而Iyer等[49]最近发现CRISPR/Cas9编辑后的小鼠胚胎细胞脱靶突变比较罕见,与天然发生的突变频率相当。目前,尚无研究报道CRISPR/Cas9技术对PERV基因编辑后猪供体器官是否会出现脱靶效应。因此,该方法还在探索阶段,需要进一步完善后方可应用于临床。

5 展望

PERV是WHO在异种移植领域所关注的核心问题之一,其跨种系感染的风险依然值得我们重视。目前,国内外许多学者一直在试图消除或减少PERV的潜在风险,如:筛选PERV低拷贝、低表达以及PERV-C阴性的猪种作为供体;利用微囊化包被供体细胞;利用RNA干扰技术使PERV基因沉默;利用逆转录酶抑制剂来抑制PERV的表达;利用基因编辑使PERV失活等。上述这些方法各有其优缺点,尤其是CRISPR/Cas9技术,虽然能够从根本上消除PERV的影响,但是由于脱靶效应等,还暂时不能应用于临床。PERV跨种系感染风险仍是阻碍异种移植大量应用于临床的障碍之一。

本课题组长期从事猪胰岛移植工作,积极探索消除PERV潜在影响的方法,目前已经筛选了一些PERV-C阴性的猪种进行培育,如果结合RNA干扰技术和CRISPR/Cas9技术对这些猪种进行改造,有望获得适合中国人群的异种胰岛移植供体猪,为临床大规模开展异种胰岛移植提供可靠的候选供体。

综上所述,了解PERV的特性,探索其预防策略,将有助于推动猪作为异种移植供体在临床中的应用。