沙门氏菌和单增李斯特菌诱导性耐酸响应机制的研究进展

田牧雨，张一敏，董鹏程，毛衍伟，梁荣蓉，朱立贤,*，罗 欣,2

（1.山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰安 271018；2.江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心，江苏 南京 210095）

近年来，食品安全问题已成为全球关注的重大问题，其中食源性致病菌是影响食品安全的主要因素之一，由食源性致病菌引起的疾病给人类健康带来了严重危害，是食品安全的重大隐患。其中根据危险性评估，沙门氏菌（Salmonella spp.）、单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）和大肠杆菌O157:H7（Escherichia coli O157:H7）是3 种重要的肉源性致病菌，引起危害的可能性最大[1]。如何主动、有效地消除沙门氏菌、单增李斯特菌等致病菌对生产企业造成的损失已经成为人们关注的焦点。

沙门氏菌属是肠杆菌科的一个大属，在自然界分布广泛、种类繁多，目前已检测出的沙门氏菌血清型有2 500余种，我国已报道的有292 种血清型[2]。沙门氏菌广泛存在于猪、牛、羊、家禽、鸟类、鼠类等多种动物的肠道和内脏中，主要通过污染水和粪便传播。绝大多数的本属细菌对人和动物均有致病性，能引起人和动物产生败血症与胃肠炎，甚至流产，并能引起人类食物中毒，是世界范围内危害公共卫生的首要或次要致病菌[3]。根据欧洲食品安全管理局的数据统计，每年仅在欧盟就有超过10万 例人体感染病例报告，据估计，每年人类因感染沙门氏菌而患病的总体经济负担可能高达30亿 欧元[4]。

单增李斯特菌是一种人畜共患的病原菌，2002年世界卫生组织把单增李斯特菌列为第四大主要的食源性致病菌[5]。单增李斯特菌在自然界中广泛存在，有研究报道，单增李斯特菌可对肉、奶、蛋、水产品及蔬菜等产生不同程度污染，以对肉及肉制品的污染最严重[6]。单增李斯特菌能导致败血症、脑膜炎以及胃肠炎等，食物中毒症状主要表现为发烧、痉挛、寒颤、头疼、腹泻和呕吐等，特别是老人、孕妇、儿童和免疫力低下的人群易受单增李斯特菌感染。单增李斯特菌引起的死亡率达到20%～30%[7]，我国各地食品监测结果显示单增李斯特菌污染在肉及肉制品中普遍存在。此外，单增李斯特菌在4 ℃下仍然能生长繁殖，所以食用未加热的冷藏食品会增加食物中毒的危险。

肉类生产企业经常采用有机酸对微生物进行消减，如在牛羊肉的屠宰线末端，以有机酸喷淋的形式用于胴体减菌[8]，或者在肉制品生产的过程中以其盐的形式直接添加其中来达到抑菌的效果[9]。但是有研究发现沙门氏菌和单增李斯特菌在弱酸环境中生长一段时间后，其后续的耐酸力增强，且能产生诱导性耐酸响应（acid tolerance response，ATR），这一反应能增强细菌穿越胃酸屏障的能力并提高其毒力，导致高危菌株的出现，对人类的健康造成很大威胁。

1 ATR概述

1.1 ATR的简介及危害

Foster等[10]首次提出ATR后、细菌（如乳酸菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌等）在酸应激条件下的适应性反应逐渐得到广泛关注。ATR是指微生物在亚致死pH值酸环境中培养一段时间后（酸适应过程），其抵抗致死性酸环境（酸激过程）能力提高的一种反应，也称作耐酸性应激[11-13]。ATR可增强细菌在酸性食品中的生存能力，同时产生交叉保护，提高菌株耐热、耐氧化、耐渗透压的能力，增加毒力基因的表达，增强细菌的潜在毒性[14]，使其在极端的胃酸环境中也能存活，对人类的生命健康造成了很大的威胁。在近30 年里，有许多从分子机制上对ATR的研究，其中不同环境参数对沙门氏菌ATR的影响以及ATR和毒性之间的关系研究甚多[15]。

1.2 弱酸环境下沙门氏菌和单增李斯特菌ATR的研究历程

Foster等[10]最开始研究ATR是在鼠伤寒沙门氏菌细胞生长的对数期，为增加其适应过程，细菌从pH 7.6环境移到弱酸（盐酸调至pH 5.8）环境培养，随后在普遍致死的pH值（3.3）环境中进行酸激，发现弱酸环境中生长的鼠伤寒沙门氏菌具有抵抗强酸的能力。随后的其他研究也使用了类似的方法对对数期鼠伤寒沙门氏菌的ATR进行研究[13,16-17]。稳定期的鼠伤寒沙门氏菌在中等酸性条件下也能产生ATR[18-19]。此外，有学者通过研究细菌在添加了葡萄糖等可发酵糖类的培养基中的繁殖情况，发现发酵产物使培养基的pH值降低，细菌也产生了ATR。早期的研究使用了含无机酸或葡萄糖的培养基作为诱导环境，随着研究深入，人们逐渐发现采用添加有机酸培养基短时诱导同样可以使鼠伤寒沙门氏菌产生ATR[20-22]。

单增李斯特菌的ATR也引起了人们的关注，单增李斯特菌在通过胃的过程中以及在巨噬细胞吞噬体中短暂停留时，都会遇到酸性环境。单增李斯特菌具有许多潜在的抗应激机制，可以在酸性环境下生存和增殖，这可能是其中的一种致病机理[23]。O’Driscoll等[23]研究发现单增李斯特菌在pH 5.5酸性培养基中适应1 h，其在致死性pH 3.5酸性培养基中存活率显著升高。Davis等[24]研究发现单增李斯特菌在pH 4.0～6.0的培养基中诱导培养不同时间均可使其产生ATR，而在pH 5.0的培养基中诱导培养1 h时单增李斯特菌最容易产生ATR。Samelis等[25]研究发现酸适应的单增李斯特菌比非酸适应的单增李斯特菌更耐酸，同时猜测培养基中含葡萄糖对单增李斯特菌耐酸的影响。Koutsoumanis等[11]研究了pH 4.0～7.0有机酸对单增李斯特菌诱导耐酸的影响，结果发现在温和酸性，即pH 5.0～6.0的环境中能提高其后续在pH 3.5的培养基中的存活率；然而，这种适应性反应强烈依赖于其他环境条件，例如诱导培养时的温度或盐浓度；另外，葡萄糖的存在使单增李斯特菌在pH值为3.5的条件下得以存活。除了亚致死性酸应激以外，其他应激（如高盐、高温和低温应激等）并不影响单增李斯特菌的耐酸性，但随着盐浓度的增加，细菌对酸的敏感性增强[11]。Zhang Yimin等[26]研究报道了有机酸诱导单增李斯特菌产生耐酸性可能与酸根离子的存在有关。另外，有学者研究发现浮游态的单增李斯特菌长时间暴露（16 ℃、15 d）在弱酸环境（pH 4.5）中，在不锈钢设备上的附着力增强，同时附着细菌对强酸（pH 2）的抗性也有所提高[27]。因此，当应用酸性去污剂来清除食品设备上的单增李斯特菌时，应考虑细菌产生的ATR。

有机酸因具有特殊的解离常数与良好的细胞膜通透性，灭菌能力和引发ATR的能力远远高于无机酸。Álvarez-Ordóñez等[20]对不同类型有机酸（乳酸、醋酸、苹果酸、柠檬酸、盐酸）的诱导能力进行了研究，发现柠檬酸诱导能力最强，而盐酸诱导能力最弱；同时，该研究证明了乳酸和醋酸也具有较强的诱导能力。由于在食品加工中乳酸和醋酸被广泛使用，因此有机酸的合理使用和选择是影响食品安全的重要因素。

1.3 影响细菌产生ATR的主要因素

引起细菌产生ATR的因素有很多，除了不同种属、不同血清型的细菌有自身特性外，还包括诱导时间、诱导pH值、诱导温度、酸激pH值、酸激时间、细菌的生长时期、诱导培养基组成成分、酸激培养基的组成成分、酸激温度等。

1.3.1 内部因素

已经有部分研究显示，不同血清型的沙门氏菌的耐酸性存在广泛差异[28-29]，这些研究也显示出本底耐酸性与细菌菌株的致病能力之间存在一定的关系。Berk等[28]对37 株沙门氏菌进行研究发现，来源于患者体内的27株沙门氏菌菌株的耐酸性高于来源于食品的菌株，并且还发现高毒性的DT104沙门氏菌菌株具有较强耐酸性；这些结果显示细菌产生的这种耐酸性可以很好地提高其在宿主中的存活能力，导致较高的致病性。另外，Zhang Yimin等[26]对4 株单增李斯特菌的ATR进行研究发现，不同血清型的单增李斯特菌ATR也存在显著差异。

1.3.2 环境因素

细菌在生长繁殖过程中存在的诸多不利条件会使细菌产生一定的抵抗力。事实上，这些外界环境因素比个体因素或菌株种类的影响更大。生长时期对细菌产生ATR有着重要的影响，且对数期和稳定期诱导性耐酸机制存在差异，处于稳定期的细菌具有更强的耐酸能力[26]。

培养基的组成成分是影响ATR的重要因素。Tiwari等[17]研究了一种复合培养基（营养肉汤）和一种基本培养基（含葡萄糖）对沙门氏菌ATR的影响，结果发现复合培养基可使沙门氏菌产生更强烈的ATR；同时也发现相较于在未酸化的培养基，鼠伤寒沙门氏菌在酸化的培养基中能产生更强的ATR。Kwon等[30]采用几种短链脂肪酸对鼠伤寒沙门氏菌进行诱导，发现经乙酸和丙酸诱导产生的耐酸性显著高于经其他短链脂肪酸（丁酸和戊酸）诱导的处理组。Greenacre等[31]将鼠伤寒沙门氏菌在胰蛋白胨大豆肉汤中培养1～6 h，用乙酸或乳酸调节pH值至5.0、5.5、5.8，结果显示，沙门氏菌在乙酸中培养比在乳酸中培养更易产生ATR，各种酸诱导沙门氏菌产生耐酸力如下：柠檬酸＞乙酸＞乳酸＞苹果酸≥抗坏血酸。

有关温度对细菌ATR影响的研究较少。Samelis等[32]以含葡萄糖的培养基和培养温度10～30 ℃为诱导条件对稳定期的鼠伤寒沙门氏菌进行处理，结果显示，与30 ℃相比，10 ℃下的鼠伤寒沙门氏菌其稳定期的ATR显著下降；同时，将伤寒沙门氏菌和单增李斯特菌在10 ℃条件下培养7 d后测定了细菌的耐酸能力，结果发现与中性环境相比，微酸的环境显著增加了两种细菌的耐酸能力，但是这种耐酸能力显著低于37 ℃处理组，该结果表明温度对这两种食源性致病菌的ATR均有影响。Tiwari等[17]发现30～45 ℃生长环境并未对鼠伤寒沙门氏菌ATR产生明显影响。但有其他实验结果显示，生长温度是改变鼠伤寒沙门氏菌ATR的一项重要因素，并且与25、37 ℃和45 ℃相比，低生长温度（10 ℃）可降低鼠伤寒沙门氏菌耐酸性[15]。Tiwari等[17]报道冷藏条件（4 ℃）培养的鼠伤寒沙门氏菌缺乏耐酸性，这些研究揭示了在食品加工过程中保持低温可在一定程度上抑制ATR的形成。

酸激培养基的组成成分和酸激温度是影响ATR最重要的两个酸激因素。在鼠伤寒沙门氏菌ATR的研究中已经涉及了许多酸激介质（酸化的实验试剂——模拟胃液和酸性食品）和酸激pH值对其的影响。Leyer等[33]对盐酸诱导后的鼠伤寒沙门氏菌以乳酸、丙酸和乙酸分别进行酸激，结果发现乳酸对鼠伤寒沙门氏菌的致死性最强。但Samelis等[32]用pH 3.5～3.7的乳酸和乙酸分别酸激含葡萄糖的培养基诱导后的鼠伤寒沙门氏菌，发现鼠伤寒沙门氏菌对乙酸更加敏感。

2 细菌产生ATR的分子机制

沙门氏菌和单增李斯特菌在弱酸环境下的ATR是细胞内发生的复杂生理生化反应，其中主要包括pH值稳态系统、应激蛋白分子的调控、细胞膜组成和流动性控制等。这些系统涉及到各种基因和蛋白的表达与调控，以及细胞抵御酸应激条件的防御系统的表达和特性。

2.1 pH值稳态系统

细菌有很多维持pH值稳态的机制，包括F0F1-ATPase系统、精氨酸脱羧酶（arginine decarboxylase，ADC）系统、赖氨酸脱羧酶（lysine decarboxylase，LDC）系统、谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）系统等。

F0F1-ATPase是一种多亚基酶，能够参与维持细胞内pH值的稳态。细菌胞外与胞内存在一定的pH值梯度差，当其增加并达到峰值时，诱导产生的F0F1-ATPase通过质子排出产生质子迁移力（proton motive force，PMF）。PMF可以促使胞内质子排出从而提高胞内pH值来维持pH值平衡和细胞存活[34]。

在pH值为7.6～7.8的情况下，即使革兰氏阴性菌在生长过程中细胞外pH值发生变化，细胞内的pH值也会保持不变[35]。在低pH值的环境中，细胞质会通过排出质子来维持细胞内pH值的稳定。此外，有学者指出LDC和ADC系统的诱导在维持细胞内pH值稳定方面也起着重要的作用[15-16]。LDC系统由一种转录调节因子（CadC）、一种赖氨酸脱羧酶蛋白（CadA）和一种赖氨酸-尸胺逆向转运蛋白（CadB）组成。当细菌处在低pH值环境下，位于细胞膜中的CadC蛋白可以作为信号的感应器或转录的启动子来激活细胞内部的LDC系统，当该系统被激活后，LDC首先会结合1 个质子使赖氨酸脱羧生产尸胺，并由反向转运蛋白带出，同时提高细胞内pH值。Lee等[16]将CadC描述为一种与OmpR-EnvZ调节系统有关的全局性调节因子，它控制了在沙门氏菌中超过36 种蛋白的表达，这表明在极端酸性条件下，细菌的生存与LDC系统息息相关。最近的一项研究发现，当柠檬酸诱导后的海德堡沙门氏菌（Salmonella Heidelberg）暴露在致死pH值下，其生存率提高并且cadA、cadB、adiA和adiY基因表达上调[36]，这说明海德堡沙门氏菌在抵抗酸应激时LDC和ADC系统会调控pH值稳态系统，其中以LDC为主要的调控系统。

另外，有机酸以未解离的形态经自由扩散穿过细菌细胞膜直接进入胞内，由于胞内接近中性的pH值环境，未解离的有机酸在胞内解离，使pH值降低，细胞内外产生的pH值梯度差使氨基酸转移并影响了其他多种细胞内的代谢活动。早期的研究表明，鼠伤寒沙门氏菌在弱酸环境下ATR的产生依赖于蛋白质的从头合成，与依赖镁离子的质子转位ATP酶有关，该实验利用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳研究发现鼠伤寒沙门氏菌在弱酸（pH 5.8）下适应1 h，18 种蛋白质表达发生了改变，其中6 种被抑制，而12 种被弱酸诱导表达[37]。近年来有研究显示，单増李斯特菌产生的ATR可能与有机酸酸根离子的存在有关，即与细胞内酸根离子的累积有关，酸根离子的累积会引起细胞内渗透压的升高，同时导致胞内的一些代谢物质会发生改变，从而影响其后续的耐酸性[26]。

GAD系统广泛存在于有机体的细胞中，当细菌暴露在酸性环境下，能催化L-谷氨酸脱羧生成γ-氨基丁酸（γ-aminobutyrate，GABA）和CO2，从而消耗细胞内质子导致胞内pH值增加，维持胞内稳态。GABA的合成和分泌是细菌抵抗极端酸性环境的重要机制[38]。Cotter等[39]发现单增李斯特菌变异株的GAD活性与耐酸水平显著相关，表明了在酸性环境下，GAD是维持pH值稳态的关键因子。

2.2 应激蛋白分子的调控

近年来，有很多学者发现并鉴定出与环境压力相关的保护性蛋白质。细菌为了防止或修复由于酸应激对自身高分子物质的损害，在ATR过程中产生了酸休克蛋白（acid shock proteins，ASPs）。在沙门氏菌中，这些应激蛋白包括替代σ因子的RpoS、铁吸收调节蛋白、双组分信号传导PhoP/PhoQ和OmpR-EnvZ反应调节器[35]。大多数被鉴定的ASPs都涉及到细胞调控、能量代谢、分子监护、转录、翻译、菌毛合成、细胞信号和毒力等各个方面[40]。

有研究发现单增李斯特菌的ATR受SigB（σB）调控。σ因子是在RNA聚合酶中起关键作用的可解离的蛋白亚单位，在特定环境条件下识别启动子并启动转录。当细菌暴露在特定的压力环境下时，σ因子被激活并进一步启动调控基因的转录。单增李斯特菌的σB因子与革兰氏阴性菌应激的主要调节蛋白RpoS都属于Sig70，它们能全局调控细菌中多种基因的表达并对细胞外的环境变化产生应答[41]。

Lund等[42]认为，根据生长阶段的不同，几种调节蛋白参与调控ASPs的不同子集。替代σ因子的RpoS和OmpR-EnvZ反应调节器可在ATR的稳定期感应ASPs。而Fur和PhoP/PhoQ参与了对数期ATR中ASPs的表达。特别地，在有机酸应激下，Fur通过调节细菌的铁代谢来调控ASPs的合成，从而对ATR产生影响；而PhoP/PhoQ则参与了无机酸应激下ASPs的一系列反应变化。Álvarez-Ordóñez等[43]研究表明，沙门氏菌在酸应激条件下会发生复杂的反应，该反应在各种基因的调控下会涉及大量具有调节细胞代谢、修复大分子损伤等不同功能的ASPs，且这些ASPs的诱导信号存在差异。因此，为了更清楚地阐明ASPs与细菌的存活和毒性的关系，有必要对ASPs做进一步研究。

2.3 细胞膜组成和流动性调控

2.3.1 沙门氏菌和单增李斯特菌细胞膜的组成

鼠伤寒沙门氏菌等革兰氏阴性肠道细菌的细胞壁是由3 个形态不同的层组成的复杂结构，包括细胞质膜、肽聚糖层和细胞外膜。Osborn等[44]认为，细菌的细胞外膜大约有60%的蛋白质存在。单增李斯特菌是一种革兰氏阳性菌。革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，肽聚糖含量丰富，且大多数脂质都集中在细胞质膜，其中磷脂占总极性膜脂的88%。单增李斯特菌的细胞膜脂肪酸主要由支链脂肪酸（branched-chain fatty acids，BCFAs）、异脂肪酸C15和前异脂肪酸C17组成，与常见的细菌细胞膜有较大差异[45-46]。

2.3.2 细胞膜脂肪酸与膜流动性

细胞膜的流动性主要由脂肪酸种类和磷脂组成变化来调节。膜流动性与脂肪酸的成分和含量密切相关，高含量饱和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA）有利于膜的坚固性，而高含量的多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）则有利于膜的流动性。有学者研究发现PUFA的凝固点比SFA更低，膜PUFA的含量越高，膜流动性越高。

细胞膜的流动性与许多因素有关，脂质双分子层构成了细胞膜的基本支架，它对膜流动性起着主要的作用。若细胞膜脂肪酸构成改变，则会导致细胞膜本身以及细胞整体功能的改变，如膜的通透性、物质转运、酶的活性、信号转导、细胞分化等。Jump[47]的研究指出，PUFA可以改变胞饮与胞吐作用，调节细胞离子通道，抑制DNA聚合酶活性，调控众多基因的表达。

2.3.3 酸应激下脂肪酸及膜流动性变化

因为各种不利环境的胁迫，如温度和渗透压胁迫，可能导致细胞膜物理性质发生改变。而细菌无法使自己免受各种外部物质和化学因素的影响，细胞膜的完好是其生存的必要条件。此外，细菌细胞质膜作为一种可渗透的屏障，控制着物质的运输，包括细胞中的溶解物。因此，在流体状态下的细胞膜会将重要的代谢物包括营养物质输送到细胞质中。通过调节膜流动性可保证膜的生物活性状态。然而，当有害物质如有毒物质出现时，为了防止它们进入细胞，膜的流动性会降低。

单增李斯特菌存在一个适应系统，能够耐受一个较宽的pH值（4.1～9.0）环境范围。在碱性条件下，主要是BCFAs发挥作用，而不是通过改变不饱和脂肪酸（unsaturated fatty acid，UFA）的数量增加膜流动性。相反，BCFAs在暴露于酸的环境下会减少[48]，Bonnet等[49]研究发现一旦细胞通过增强膜的硬度来适应酸性环境，那么它们就会获得对Nisin的交叉耐药性。在家禽屠宰和加工过程会使用酸性化学去污剂如柠檬酸，当细菌暴露在亚致死浓度的环境时，这些酸性化合物通过细胞降低了膜的流动性，使细菌对酸性化合物产生抗性[50]。

乳酸通常作为杀菌剂以减少家畜中沙门氏菌等细菌的数量；然而，它的使用可能会引起沙门氏菌对其他环境压力产生抗性[51]。沙门氏菌暴露于亚致死的酸性环境下，其膜流动性会降低，从而导致更高程度的耐酸性，即沙门氏菌通过降低UFA与SFA的比率，并增加环状脂肪酸的数量，从而适应了微酸环境。

总体来看，革兰氏阴性细菌在ATR中主要是降低了UFA与SFA的比率，少量增加了环状脂肪酸的含量。相比之下，除了改变UFA与SFA的比值外，革兰氏阳性细菌还能通过调节BCFAs的数量或其脂肪酸链的长度来调节膜相，以应对恶劣的环境因素[52]。

3 结 语

ATR使细菌可以在极端的酸性环境下生存，这一反应是危害人类生命健康的重要因素。近30 年来，细菌的ATR对食品安全的影响越来越受关注，很多研究表明细菌产生ATR是一个细胞内复杂的生理生化反应，与各种不同的影响因素和许多分子机制密切相关。关于ATR的分子机制的研究主要集中在pH值稳态系统、应激蛋白分子的调控、细胞膜组成和流动性控制等方面，这些研究主要通过分子层面阐述了ATR产生的机制。迄今为止，绝大多数的研究都是用各种不同的实验室培养基进行酸适应和酸激来分析细菌的ATR，但在体内研究中，很少有实验明确说明细菌ATR在食品链和宿主中的联系。近年来，有学者使用了一种诱变的信号来标记识别家畜胃环境中使鼠伤寒沙门氏菌存活的重要基因；此方法在未来可以被用来阐述细菌在酸性食物中或其他不利环境下存活所必需的分子系统，这将会成为研究细菌产生ATR的一个新热点。