柴胡地上部分成分分析及其解热镇痛活性研究

袁小晶 程雪丹 余 马 索志荣 叶 平 秦海燕

(1. 西南科技大学生命科学与工程学院 四川绵阳 621010； 2. 西南科技大学分析测试中心 四川绵阳 621010)

柴胡(BupleurumchinenseD C)属伞形科柴胡属,多年生草本植物,其干燥根为传统中药,具有镇静、止痛、抗菌消炎、保肝利胆、抗病毒等功效。一直以来人们对于柴胡的研究多集中于根部皂苷类成分，但近年不断有实验研究发现柴胡地上部分(柴胡茎、叶)也含有多种有效成分[1]。“中柴2号”为四川德培源中药科技开发有限公司、中国医学科学院药用植物研究所、西南科技大学等单位通过多年努力，选育出通过专业主管权威机构鉴定认证、符合 2015 版 《中国药典》要求的北柴胡品种，并在四川省广元市进行了大面积栽培，该公司生产的柴胡根用以入药，地上部分茎叶弃之不用,造成“中柴2号”柴胡资源大量浪费。

近年来，将中草药添加于动物饲料以预防疾病或改善畜禽生产性能成为养殖业的研究热点。宣清良等[2]使用柴胡蒸馏液治疗妊娠母猪的持续高热，取得了良好效果。彭国海[3]使用柴胡细辛煎汁治疗猪的感冒，可以有效缓解感冒症状，降低体温，提高摄食量。目前柴胡地上部分应用于畜牧生产的研究不多，从其药用和营养的双重作用来看，其应用于缓解畜禽热应激和提高机体免疫力有着广泛的应用前景[4]。本论文对“中柴2 号”柴胡地上部分的化学成分进行定性和定量分析，并测试其解热镇痛活性，以期为柴胡地上部分应用于动物饲料或动物疾病治疗提供理论依据，也为扩大柴胡的药用部位提供理论支持。

1 实验

1.1 材料与方法

雌雄小白鼠(SPFKM品系)各80只，质量(20±2 g)，由成都达硕实验动物有限公司提供。

“中柴2号”柴胡购自四川德培源中药科技开发有限公司，产地绵阳安县花荄镇、广元青川县竹园镇、马鹿乡。

芦丁、槲皮素、山奈素、异鼠李鼠，购自中国药品生物制品检定所；柴胡皂苷a、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d，购自成都普菲德生物技术有限公司；乙腈、甲醇，购自Fisher公司；LPS购自上海依赫生物科技有限公司。

旋转蒸发器(R-301)，购自于上海申顺生物科技有限公司；液相色谱仪(ULtiMate 3000 DGLG)，购自中国赛默飞世尔科技有限公司。

1.2 色谱条件

HypesiL GOLD色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)；梯度洗脱程序(0～5 min，10%～30%A；5～25 min，70%A)；流速为0.8 mL·min-1；柱温检测为30 ℃，进样量10 μL，运行时间25 min，检测波长210 nm。

1.3 供试品溶液的制备

精密称取柴胡细粉1.0 g，加入甲醇溶液50 mL，密塞，超声处理(功率200 W，频率40 kHz)30 min，过滤，用甲醇20 mL分两次洗涤容器和药渣，洗液与滤液合并，减压旋蒸，加甲醇溶解并转移至10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

1.4 线性关系考察

吸取制备的混合标准品储备溶液，稀释，制得浓度分别为初始浓度的1/250，1/50，1/20，1/5，1/1的混合对照品溶液，各取10 μL注入色谱仪中测定，按上述色谱条件依次进样测定峰面积，以进样量X(μg)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，得到线性回归方程。

1.5 解热实验(内毒素致热)

取实验用小鼠30只，于实验前置于恒温的适应环境中。实验前测定小鼠的肛温，并挑选出18只体温在38 ℃以下且体温体重接近的小鼠，并将其平均分为3组，分别为柴胡组、模型组、空白对照组。

柴胡组和模型组小鼠分别腹腔注射LPS溶液0.2 mL，使其发热，空白对照组小鼠腹腔注射0.2 mL蒸馏水；柴胡组小鼠灌胃15 mg·mL-1柴胡煎煮液0.2 mL，剩余两组灌胃等量蒸馏水，每隔0.5 h测一次肛温，持续测量180 min，以基础体温为基数，计算各测定时间点小鼠体温变化ΔT(℃)。以时间为横坐标，ΔT为纵坐标绘制体温变化曲线，计算各个实验组在体温达到峰值后的下降幅度[5]。

1.6 镇痛实验(热板法)

选取24只舔足时间在40 s以下的雌鼠，平均分为3组，分别为低剂量(10 mg·mL-1)、中剂量(15 mg·mL-1)和高剂量(20 mg·mL-1)组，记录基础舔足时间，并给其进行腹腔注射对应浓度的柴胡煎煮液0.2 mL。于10,30,60 min后测量痛阈值，计算痛阈抑制率。痛阈抑制率(%)=(给药后痛阈值-给药前痛阈值)/给药前痛阈值×100%[5]。

2 结果与讨论

2.1 柴胡地上部分含量测定结果

柴胡中黄酮与皂苷标准品及供试品HPLC色谱图如图1所示。

图1 混合对照品和样品的色谱图

根据柴胡皂苷a、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、芦丁、槲皮素、异鼠李素、山柰素的回归方程，计算发现“中柴2号”柴胡地上部分含有较高的黄酮类成分和少量的皂苷类成分，黄酮类成分含量范围为2.01～8.75 mg·g-1，其皂苷类成分含量0.103～0.459 mg·g-1。其中黄酮类化合物对人体肿瘤、衰老、心血管等疾病的治疗和预防有重要意义[6]，由此可知，“中柴2号”柴胡地上部分亦有显著的药用价值。

2.2 解热作用

如图2，表1、表2所示，各组小鼠腹腔注射LPS后，1.5～2.5 h达到峰值，与基础体温比较，除空白对照组外，各组小鼠体温变化均大于0.6 ℃，表明造模成功。计算给药组小鼠体温变化ΔT(T1.5 h与T3.0 h体温差值)、T1.5 h(T1.5 h与基础体温差值)。计算体温下降幅度(%)=ΔT/ΔT1.5 h×100%，模型组和柴胡组体温下降与对照组相比均有显著性差异(P<0.05),表明柴胡地上部分煎煮液有显著的解热作用。张云波等[7]研究表明，柴胡黄酮部分和其他物质在解热效应中发挥重要作用，能协同增强解热效果。说明“中柴2号”柴胡地上部分黄酮类成分在发热动物的解热中发挥了作用。

图2 各组小鼠不同时间的体温变化趋势

表1 各组小鼠不同时间的体温

表2 各组小鼠体温的下降幅度(n=6)

2.3 镇痛作用

表3表明，不同浓度的柴胡地上部分煎煮液的镇痛效果不同。后续试验选择浓度为15 mg·mL-1的柴胡地上部分煎煮液。

表3 不同浓度煎煮液在不同给药时间后的镇痛作用

表4表明，与空白组对照，柴胡地上部分煎煮液镇痛作用显著，且随着注射时间的增长，柴胡地上部分的镇痛效果在一定范围内呈递增趋势，其中给药30 min后镇痛效果最好,0～1 h内达到峰值。这是因为柴胡地上部分含有柴胡皂苷等水溶性成分，对神经系统有明显的抑制作用，从而发挥良好的镇痛作用[8]。

表4 热板法试验结果(n=6)

3 结论

“中柴2号”柴胡地上部分含有较高的黄酮类成分，含量范围2.01～8.75 mg·g-1，皂苷类成分含量达0.103～0.459 mg·g-1，而且其镇痛效果在一定范围内呈递增趋势， 0～1 h内达到峰值，说明柴胡地上部分可以作为药用植物资源加以充分利用。中草药饲料添加剂毒副作用小、不易产生抗药性，是一种具有营养作用和抗病作用的绿色饲料添加剂。柴胡地上部分产量大，取材方便，地上部分用于动物饲料添加剂或兽医临床应用可以在一定程度上减少化学药品出现的耐药性或者器官毒性等问题。广元市已推广“中柴2号”约667 hm2，深入研究如何正确合理地使用柴胡地上部分作为中草药饲料添加剂，不仅对动物疾病预防与控制发挥十分明显的积极作用，也极大提高了中药柴胡的经济效益。