数字PCR在肺癌诊疗中的应用研究*

王 萍，韩苗苗，朱雁风 综述，席守民 审校

(河南科技大学：1.医学院；2.材料科学与工程学院，河南洛阳 471000)

1985年由MULLIS发明的聚合酶链式反应(PCR)技术是生命科学领域的一项重大成就。第一代传统的PCR技术需要根据琼脂糖凝胶电泳结果对扩增产物进行定性和半定量分析，并且容易产生假阳性。第二代的实时荧光定量PCR(quantitative PCR，qPCR)利用荧光探针或染料实现对靶标基因的定量分析，但其定量过程需依赖于内参基因或标准曲线，所以用于检测核酸分子只是相对定量，并且其灵敏度也不能完全满足分子生物学研究的需求。数字PCR(digital PCR，dPCR)是第三代PCR技术，可实现对核酸拷贝数的绝对定量，不受扩增曲线的循环阈值(cycle threshold，Ct)、内参基因和标准曲线的影响，并且灵敏度和准确度更高，这些优点使得它在众多领域迅速得到应用。

1 dPCR技术的原理

1992年，SYKES等[1]使用有限稀释、PCR和泊松分布检测了低丰度的IgH重链基因突变，这一研究奠定了dPCR的雏形。1999年，VOGELSTEIN等[2]在检测结肠癌患者粪便中Kras基因突变时，通过将样本DNA稀释并等分到384孔板中进行微升级的PCR反应，从而实现对样品中的Kras突变进行定量的目的，并首次正式提出了dPCR的概念。从广义上讲，经典的PCR技术可以用于定性或定量分析，即研究目标分子的性质或确定目标分子的数量。dPCR与经典的PCR在这方面类似，不同之处在于dPCR技术在PCR扩增前将模板DNA稀释到单分子水平并分散至许多微反应单元，这导致在每个反应单元中的模板数为0或1个。在PCR扩增后，含有靶DNA序列的反应单元会显示荧光阳性信号(定义为“1”)，而没有靶序列的单元中只能观察到背景荧光(定义为“0”)。然而，通常每个反应单元中可含有至少两个DNA模板分子，因此必须使用泊松分布公式进行校正，以减少反应单元中由多个目标模板的出现产生的误差[3-4]。最后，根据泊松分布和荧光信号阳性反应单元与所有反应单元的比例，实现量化靶DNA的初始拷贝数或分析靶分子性质的目的。

2 dPCR技术的分类

根据反应单元形成的方式，dPCR技术主要分为三类：微反应室/孔板、微流控芯片和微滴dPCR。

2.1 微反应室/孔板dPCR 微孔板式dPCR是最早出现的dPCR技术。dPCR技术初期就是通过手工逐级稀释并将样品分配至96或384微孔板中进行PCR反应。这种操作方式不仅繁琐、试剂消耗量大、检测通量小，其灵敏度也不能满足实验需求。除了PCR的扩增效率外，dPCR技术的检测灵敏度主要取决于样品分解的反应单元数目n。理论上，反应单元数目越多，dPCR的灵敏度越高，其检测的准确度也越高。MORRISON等[5]通过使用不锈钢芯片，将反应单元数达到了3 072个，每个反应单元体积只有33 nL。该芯片用于dPCR技术中，与384孔板dPCR相比，其反应体积降低了64倍，分析通量提高了24倍。但是这种方法需借助高通量自动点样仪或机械手等设备，从而增加了操作的复杂性，提高了系统的成本[6]。

2.2 微流控芯片dPCR 由于微流控技术可以实现液体样品纳升甚至皮升级的分解，因此待测样品可以获得更大分解数目，使得dPCR技术的检测灵敏度、可信度和动态范围度得到极大改善。同时，通过使用微流控芯片可以进行多个平行反应，它具有体积小、成本低和通量高的优点，是理想的dPCR平台。目前，国内外许多研究课题组和公司已开发出以微流控芯片为核心组件的dPCR系统[7-10]，如Fluidigm公司的BioMarkTM基因分析系统和Life Technologies公司的QuantStudioTM3D系统。

2.3 微滴dPCR 液滴dPCR源于乳液PCR技术[11-12]。其核心是在PCR扩增前将反应体系进行微滴化处理，利用油包水技术将反应液分割成纳升甚至皮升级的微滴，每个液滴含有1个或0个靶分子，并且每个液滴都是一个独立的PCR反应单元，在PCR反应结束后可检测每个油包水乳滴的荧光信号以达到定量的目的。Bio-Rad公司的QX100TM和QX200TM均为使用液滴技术的dPCR系统。

3 dPCR技术的优势

3.1 绝对定量 目前，qPCR仍然是核酸定量分析中更受欢迎的方法，主要是因为成本较低。标准品或内参基因的使用是qPCR数据分析的核心，并可能因实验室而异。相比之下，dPCR采用终点荧光检测和阳性反应单元比例进行定量分析，不依赖于标准曲线和内参基因，实现真正意义上的绝对定量。

3.2 抑制剂耐受性强 与qPCR相比，dPCR对酶抑制剂的耐受性很强[13]，原因是dPCR在反应液平均分配到每个反应单元的过程中，一些PCR抑制剂也被均匀分配到反应单元中，从而降低了抑制剂对反应的干扰。而qPCR由于受到抑制剂的影响，会降低扩增效率。

3.3 高灵敏度和精确度 尽管qPCR和dPCR两种技术在核酸检测方面的荧光化学本质是相同的，但dPCR体系采用成千上万的反应分区，可以精确地检测出变化很小的目的序列。相对于qPCR，dPCR定量分析的变异系数(精确度的度量指标)明显较低[14]。此外，在模板分配的过程中降低了背景DNA和其他污染物水平，从而提高了反应单元中的信噪比，提高了检测灵敏度[15]。这一优势使得dPCR可以用于分析复杂临床标本如血液、脑脊液中游离DNA的突变，为临床用药和治疗提供更多信息。

3.4 高通量单细胞基因组测序 单细胞基因组测序是通过在单个细胞水平上对全基因组进行扩增和测序的一项新技术，可为研究单个细胞的行为、机制等提供新方向。大细胞群的单细胞基因组测序应用一直受限于基因组制备过程中隔离单个细胞的技术挑战。而数字PCR可将一个传统的PCR反应分割成数百万的独立皮升级反应，基于此，LAN等[16]利用液滴微流体技术来分离细胞，将细胞基因组碎片化并将独特的条形码加到所有基因组片段上，这种方法可以在几小时内处理50 000多个细胞。然后，所有细胞的条形码可以被汇集和测序，并通过条形码分组，提供了单细胞基因组的库。研究者利用这种方法分析了环境样品微生物群落中抗菌药物抗性基因、毒性因子和噬菌体序列的分布情况。

4 dPCR技术在肺癌诊疗中的应用

4.1 肺癌诊断 微RNA(miR)-21-5p和miR-335-3p在肺癌患者血浆中呈现异常表达[17]。MA等[18]利用dPCR分析了36例肺癌患者和38例健康对照血浆中的miR-21-5p和miR-335-3p的拷贝数。研究结果表明，qPCR只能检测到血浆中miR-21-5p的拷贝数，而dPCR可同时检测到血浆中的miR-21-5p和miR-335-3p的拷贝数，说明dPCR对低丰度核酸的检测更敏感。根据dPCR定量分析结果，血浆miRNA区分肺癌患者和健康对照的灵敏度和特异度分别为71.8%和80.6%。MiR-31和MiR-210的联合检测可用于肺癌的诊断[19]。LI等[20]利用dPCR对35例肺癌患者和40例健康对照的痰液中miR-31和miR-210进行检测，结果显示两个miRNAs联合用于肺癌诊断的灵敏度和特异度分别为65.71%和85.00%。作者的研究小组发现miR-126在肺癌患者血清中异常表达，并构建了一种基于微流控芯片的乳滴dPCR技术检测了20例早期肺癌患者和配对正常肺组织中miR-126的表达，通过分析受试者工作特征 (ROC)曲线显示，相对于qPCR，dPCR可以更准确地区分正常组织和肺癌组织[21-22]。

4.2 靶向治疗方案制订 表皮生长因子受体(EGFR)是一种肿瘤靶向治疗分子，并在国内外得到认可。EGFR突变是对小分子酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)敏感的一个强预测因子。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者EGFR基因19号外显子的缺失和21号外显子L858R错义突变可以大大提高其对TKI的敏感性[23]。YUNG等[24]利用微流控dPCR检测了35例NSCLC患者治疗前的血浆标本中EGFR基因突变，并用测序方法检测患者组织中该基因突变。结果显示，dPCR检测到血浆中19号外显子缺失突变和21号外显子L858R错义突变的比例分别为17%和26%，与组织检测相比，血浆EGFR基因突变分析的灵敏度和特异度分别为92%和100%。这表明dPCR可用于分析血浆中低丰度EGFR基因突变，并为临床用药提供依据。

4.3 耐药监测 EGFR-TKIs已被证明可有效治疗EGFR激活突变的NSCLC患者。然而，大多数接受EGFR-TKIs治疗的患者最终会产生耐药性，其中约50%的患者都具有EGFR T790M突变。WATANABE等[25]利用乳滴dPCR检测了373例具有EGFR激活突变的NSCLC患者组织中EGFR T790M突变的情况。结果显示，治疗前T790M突变的总发生率为79.9%，频率为0.009%～26.9%，由于大多数治疗前T790M突变频率低于0.1%，临床上常规检测方法无法检测到。因此，dPCR更适合于微量样品的T790M突变检测，有潜力作为高灵敏度的诊断工具用于个体化治疗的选择。

虽然组织标本对于研究EGFR-TKIs的耐药机制十分重要，但是对于有些NSCLC患者来说，获取组织标本十分困难，并且组织标本的连续获取对患者来说创伤性也很大。据报道，肺癌患者血浆标本中循环游离DNA(circulating cell-free DNA，cfDNA)的水平高于健康人[26]，循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)是cfDNA的一部分，并且肿瘤患者的ctDNA可反映肿瘤突变信息，与肿瘤组织具有良好的一致性，并且ctDNA的检测具有连续、方便和微创的优势，但其在血浆中的含量很低[27-29]。基于此，ISHII等[30]利用dPCR检测了NSCLC患者血浆中T790M突变，检测的灵敏度和特异性分别为81.8%和85.7%，并且血浆和组织标本中突变的一致性高达83.3%。这表明dPCR可以作为高灵敏的检测方法用于血浆标本中T790M突变的检测，为耐药监测提供依据。OXNARD等[31]利用乳滴dPCR在NSCLC患者的血浆标本中通过对EGFR和KRAS基因突变定量检测，可以提前几周预测临床耐药性的发生，从而指导治疗。

4.4 预后预测 WANG等[32]利用dPCR和突变阻滞扩增系统(amplification refractory mutation system，ARMS)监测了135例晚期NSCLC患者用EGFR-TKI治疗6个月后的生存情况。结果显示，dPCR对于ctDNA中EGFR T790M突变的检测限为0.03%。在TKI治疗前后的血浆标本中，dPCR检测到的T790M突变频率均高于ARMS，并且与TKI治疗前不具有T790M突变患者相比，具有T790M突变的患者的无进展生存时间和总生存时间要差。研究表明，通过dPCR检测ctDNA中T790M突变可以为EGFR-TKI预后提供一种非侵入性和灵敏的检测方法。Kras是一种致癌驱动基因，30%的NSCLC患者都有Kras基因突变，并且该基因突变与预后不良相关。GUIBERT等[33]利用dPCR检测了32例肺腺癌患者中的血浆和循环肿瘤细胞中的游离DNA。研究结果显示，循环游离DNA中Kras基因突变的检测可以作为治疗反应差的预测因子。

5 小 结

常规的PCR技术对稀有分子遗传变化的定量分析能力有限，由于dPCR具有高灵敏度和准确性，有助于检测复杂背景下的罕见突变，因此在许多领域已得到应用。这将有助于促进癌症的个体化治疗，耐药性研究及肿瘤的预后监测。尽管dPCR的第一个商业化平台已于2006年上市，并在众多领域已有应用，但与成熟的qPCR技术相比，由于dPCR技术上有一些局限性，使得它在临床上的应用仍处于初级阶段。(1)dPCR分析过程需要高度特异性的等位探针来降低反应的交叉性和假阳性。(2)需要大量的样本量来覆盖研究的突变类型。(3)样品分离过程中DNA的变性会将两条单链DNA分配到不同的反应单元中，从而导致反应结束后靶标分子的拷贝数高于实际值。相反，样品的不均匀性及分液体积的变化会导致靶标分子的拷贝数低于实际值[32，34]。虽然存在一些局限性，但随着对实验方法的不断研究，dPCR技术也会进一步完善和发展，相信dPCR技术具有广阔的应用前景，有望成为基因研究的前沿技术，并可在不久的将来作为常规技术用于临床试验。