二甲双胍对肝星状细胞凋亡的调控作用*

孔德华，李 灿，谭悦浩，刘 琴，胡康安，郭莉娜，邓峰美，刘漪沦

1. 成都医学院(成都610500)；2.成都医学院第一附属医院 科研实验中心(成都610500)；3.成都医学院第一附属医院 烧伤整形科(成都610500)

肝疾病、慢性肝损伤和炎症等刺激，使静止的肝星状细胞(HSC)活化，转化为肌成纤维细胞，分泌大量的细胞外基质(ECM)，ECM产生和消除失衡造成肝纤维化[1]。目前，研究[2-3]表明，ECM主要来自于活化的HSC，HSC在肝纤维化形成和逆转过程中发挥着重要作用。抑制HSC的活化和增殖，减少ECM分泌，可能是防治肝纤维化的潜在策略。

细胞凋亡是受严格调控的死亡模式，在细胞的生长发育中发挥着不可或缺的作用[4]。凋亡信号触发启动型caspase(caspase-2,-8,-9,-10,-12)，激活并剪切下游效应分子，这些效应分子会剪切PARP等靶蛋白，使蛋白发生改变，成为凋亡标志[5]。凋亡信号通路主要是线粒体内源性凋亡通路，由细胞内应激使线粒体外膜通透化而触发，受BCL-2家族成员调控[6]。Bcl-2存在于线粒体外膜，抑制细胞色素C释放，发挥抑制凋亡的作用；而Bax储留在细胞质中，接受信号后转位到线粒体外膜，促进细胞色素C释放，从而促进凋亡发生。

二甲双胍是双胍类降血糖药，作为“老药新用”的代表，具有副作用小、疗效确切的特点，主要用于2型糖尿病治疗。越来越多的证据[7-9]表明，二甲双胍除了具有强大的降血糖作用外，还有强大的抗炎、抗氧化和抗肿瘤活性。有研究[10-12]表明，二甲双胍可以抑制活化的HSC增殖、迁移和炎性细胞因子表达，对肾纤维化和非酒精性脂肪肝炎具有预防作用。二甲双胍对肝纤维化有治疗作用，但其对HSC的作用机制却还不是很清楚。本研究针对二甲双胍对HSC的作用，探讨二甲双胍治疗肝纤维化的潜在机制。

1 材料与方法

1.1 动物

从成都达硕公司购进30只SPF级别，5周龄雄性C57BL/6J小鼠。饲养温度为20～26 ℃，湿度为40%～70%。小鼠购回后检疫1周，保证充足饮食和饮水。

1.2 药物与主要试剂

二甲双胍(Santa cruz，美国)，胎牛血清(Gibco,美国)，高糖培养基(DMEMH)(Gibco,美国)，胰酶(碧云天，上海)，人源血小板衍生因子(PDGF)(CST,美国)，CCK-8试剂盒(索莱宝,北京)，AnnexinV-PE/7-ADD双染细胞凋亡检测盒(凯基，江苏)，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)蛋白上样缓冲液(碧云天,上海)，Ripa裂解液(碧云天，上海)，标记物(Maker)(Thermo,美国)，α-SMA一抗(Santa cruz,美国)，B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)一抗(Santa cruz,美国)，Bax一抗(CST,美国)，Beclin1(CST,美国)，DNA修复酶(PARP)(CST,美国)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(CST,美国)，Anti-rabbit IgG(CST,美国),Anti-mouse IgG(CST,美国)，马松染色(Masson染色)试剂盒(凯基，江苏)等。

1.3 主要仪器

灭菌锅(HVE-50)、干燥箱(JA-FA65)，CO2恒温培养箱(3111)，超净工作台,-80 ℃冰箱购自Thermo，倒置相差显微镜(CKX41)购自OLYMPUS，-20 ℃冰箱(4DF)购自海尔，流式细胞仪(Cytomics FC500 MCL)购自BECKMAN COULTER，正置荧光显微镜(Ⅸ-71)购自Olympus，离心机(离心机)购自湘仪，移液器(6Z58)购自eppendorf，电泳仪购自BIO-RAD，TS-1型脱色摇床购自江苏林贝儿仪器制造公司，优普纯水仪(UPR-Ⅱ-5)购自青岛正恒试验设备有限公司,凝胶成像系统(5diff)购自BIO-RAD等。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养及分组 将人HSC LX-2培养于含10%胎牛血清(FBS)的DMEMH。培养条件为：37 ℃，5%的CO2浓度，隔天换液，待细胞长到80%左右即进行传代。细胞分3组：阴性对照组(PBS)、阳性对照组(PDGF-BB)和药物组(PDGF-BB+Met)。

1.4.2 细胞增殖 胰酶消化细胞，加入培养基(DMEM)配制细胞悬液，96孔板中每孔加入50 μL细胞悬液，使细胞个数为1×104个，加入不含血清的DMEM饥饿2 h，加入含PDGF的DMEMH，PDGF浓度为40 ng/L，培养过夜。按实验分组加药培养24 h，其中二甲双胍的浓度为0、5、10、20、40 mmol/L， 每组设置5个复孔，培养结束后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，轻轻敲击培养板，使其混匀，放入培养箱孵育4 h，用酶标仪在450 nm处测定吸收值，计算增殖活力。

1.4.3 细胞流式 按照 1.4.2操作培养细胞，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化细胞，按照试剂盒的要求，将Binding Buffer、Annexin V-PE混合试液混悬细胞，避光反应10 min，检测前加入7-AAD试剂，孵育20 min，用流式细胞仪检测。

1.4.4 蛋白质印迹技术(Western blot) 按照1.4.2操作培养细胞，其中二甲双胍的浓度为10 mmol/L。用胰酶消化细胞，提取总蛋白，用BCA法测定每管蛋白浓度，上样用沸水煮蛋白5 min，使蛋白变性。按照浓度计算20 μg蛋白的溶液体积作为上样体积，用上样缓冲液调整每组蛋白上样体积一致，用10%的SDS-PAGE分离胶分离蛋白，然后湿转到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，用5%的脱脂牛奶封闭30 min，一抗(α-SMA、 Beclin1、PARP、Bax、Bcl-2、GAPDH)4 ℃过夜，二抗37 ℃孵育2 h，显影。

1.4.5 动物模型 将动物随机分为3组：对照组(橄榄油)、模型组(CCl4)和药物组(CCl4+Met)。检疫完成后，对照组每周两次腹腔注射橄榄油5 mL/kg， 模型组和药物组腹腔注射CCl4油溶液(橄榄油∶CCl4=3∶1)，直至第5周实验结束。第3周开始，药物组开始腹腔注射二甲双胍65 mg/kg(生理盐水溶解)，模型组注射生理盐水做阳性对照。

1.4.6 Masson染色 取小鼠肝脏，用中性甲醛固定组织，脱水后进行石蜡包埋。用石蜡切片进行Masson染色，染色结果在正置荧光显微镜下观察，用Image J分析胶原纤维分泌量。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 二甲双胍抑制HSC的增殖

在肝纤维化的发生发展过程中，受细胞环境的刺激，HSC迅速发生活化、增殖和迁移，分泌大量炎性因子如PDGF、TGF-β。为了评估二甲双胍对活化的HSC作用，用PDGF刺激LX-2细胞，模拟肝纤维化的炎性刺激，然后将加入不同浓度的二甲双胍培养24 h，检测细胞的增殖情况。研究发现，当二甲双胍对LX-2增殖的抑制作用随浓度的增大而增强，IC50为42.66 mmol/L。当二甲双胍浓度为10 mmol/L时， 细胞活力为(70.48±0.68)%，显示此剂量下的二甲双胍对细胞损害小，可以作为后续实验的依据(图1)。

图1 二甲双胍对HSC增殖的影响

2.2 凋亡相关蛋白表达升高

PDGF刺激后，Westren blot检测肝星状细胞活化标志α-SMA。与模型组相比，药物组α-SMA表达量降低(38.76±0.33 vs 19.63±3.06，P<0.001)，表明活化的LX-2受到抑制。继而检测凋亡相关蛋白的表达情况：与模型组相比，药物组cleaved PARP表达量升高(26.89±0.84 vs 36.96±0.94，P=0.003)、Bax的表达高于模型组(58.32±0.43 vs 90.55±0.10，P<0.001)，而Bcl-2的表达则明显降低(88.18±0.18 vs 22.92±0.51，P<0.001)。同时，Beclin1的表达量也明显升高(37.38±0.38 vs 85.58±0.96，P<0.001)(图2)。

图2 Western blot检测凋亡相关蛋白表达及灰度分析

注：A:Western blot检测 cleaved PARP,Beclin1,Bcl-2,Bax,α-SMA蛋白表达量；B:α-SMA，cleaved PARP，Beclin1，Bax，Bcl-2灰度分析；**P<0.01，***P<0.001

2.3 二甲双胍促进活化HSC凋亡

使用AnnexinV-PE/7-AAD凋亡试剂盒检测发现，二甲双胍促进LX-2发生凋亡，当二甲双胍浓度为5 mmol/L时，细胞凋亡率为(4.62±0.16)%(P<0.001)。与Westren blot结果一致，显示二甲双胍促进活化HSC发生凋亡(图3)。

图3 细胞流式检测细胞凋亡及凋亡率

注：A：不同二甲双胍浓度对LX-2 凋亡的作用，FL2-A：AnnexinV-PE，FLA-3:7-AAD；B:细胞凋亡率；***P<0.001

2.4 二甲双胍减轻CCl4诱导的肝纤维化

用Masson对小鼠肝脏染色，与对照组相比，模型组汇管区周围胶原纤维堆积，组织纤维化明显，而药物组则改善小鼠病理情况(162.61±1.28 vs 109.82±0.87，P=0.003)(图4)。

图4 Masson染色检测组织纤维化情况

注A:Masson染色检测胶原纤维分泌量 (100×)； B:胶原纤维含量分析；**P<0.01

3 讨论

肝纤维化是肝脏受损后产生的一系列病理过程，主要过程是HSC活化，转变为肌成纤维细胞，分泌ECM和炎症因子(如TGF-β、PDGF),当ECM出现降解失衡，便形成纤维化，进一步发展为肝硬化和肝癌，严重威胁人类健康[1]。在本研究中，使用CCl4诱导小鼠肝纤维化，通过Masson染色可以发现，模型组肝小叶周围纤维增生严重,相反二甲双胍治疗后，纤维化情况有所好转，这与已有的研究结果一致[11-13]，这些结果显示二甲双胍可以减轻CCl4导致的肝纤维化。

为了探究逆转肝纤维化过程中二甲双胍对活化HSC的作用，使用PDGF刺激LX-2细胞，模拟体内炎性环境。经过划痕实验和细胞增殖实验，发现二甲双胍能抑制活化HSC的增殖和迁移。进一步检测发现，药物组PARP表达量增加，Bax/Bcl-2的比值增加；细胞流式检测发现凋亡细胞增多，这提示二甲双胍激活了HSC的凋亡信号通路，诱导活化HSC凋亡。

自噬是调节细胞存活和死亡的重要途径，在细胞受到应激作用或受损时，自噬通过清除受损细胞，从而起到有利于机体的作用。目前，有研究[14-15]表明，自噬与延长寿命有关。已有研究[16-17]证明，Beclin1与Bcl-2的相互作用是决定细胞凋亡与自噬发生的中心环节。Beclin1与Bcl-2的相互作用，会抑制Beclin1的聚集，从而抑制自噬的发生。最新研究[18]发现，自噬关键分子Beclin1会与凋亡相关分子Bcl-2形成Beclin1/Bcl-2复合物，阻断体内这种复合物的形成，增加基础自噬量，可以延长小鼠寿命。本研究发现，药物组Beclin1的表达明显高于PDGF-BB组和对照组，提示药物组细胞发生了自噬。二甲双胍作为一种AMPK激动剂[19-20]，其作用已被广泛认可，它可以激活细胞自噬信号通路。基于Beclin1与Bcl-2关系，猜测二甲双胍通过增加活化HSC自噬，从而促进其凋亡，进而对抗CCl4诱导的肝纤维化，但其机制还需进一步研究。