HPLC法测定远志橙皮口服液中细叶远志皂苷和橙皮苷的含量

赵 丽，王显凤

1．成都市第七人民医院 药剂科(成都 610041)；2. 陆军军医大学大坪医院 药学部(重庆 400042)

远志橙皮口服液是由远志酊、橙皮酊等组成的镇咳祛痰复方制剂，临床主要针对上呼吸道感染及肺炎所致的咳嗽、咯痰等症状，其疗效肯定。远志酊是远志流浸膏加60%乙醇混合去除不溶性杂质制成的酊剂[1]，对痰不易咳出的咳嗽效果明显；橙皮酊是以橙皮为原料提取加工制成的酊剂[2]，对痰多引起的咳嗽效果明显。目前，由于该制剂质量标准尚缺乏对远志酊和橙皮酊的含量测定，影响了其临床应用。本研究拟采用HPLC法对远志橙皮口服液中远志酊所含细叶远志皂苷和橙皮酊所含橙皮苷进行含量测定[3-4]，在确保临床用药安全有效的同时进一步加强其质量稳定可控。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器 Agilent 1200系列安捷伦高效液相色谱仪(Agilent Chemstation工作站，安捷伦科技有限公司)； 赛多利斯 BT25S 电子天平[Max 21 g,d=0.01 mg,赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；KQ-500E型超声波清洗器(频率：40 kHz，超声电功率：500 W，清洗容量：22.5 L,昆山市超声仪器有限公司)。

1.1.2 试剂 国家药品标准物质细叶远志皂苷(使用前不需要干燥处理，2～10 ℃保存，批号：100033-201308，特性量值：含量以91.6% 计，规格：20 mg/支)和橙皮苷(使用前不需要干燥处理，2～10 ℃保存，批号：110721-201115，特性量值：含量以96.1%计，规格：20 mg/支)均由其研制发行单位中国食品药品检定研究院提供；甲醇为B&J ACS/HPLC溶剂，磷酸、盐酸、正丁醇等均为AR试剂，水为超纯水；远志橙皮口服液 (自制，批号：150506-S1、150506-S2和150506-S3)。

1.2 方法

1.2.1 远志橙皮口服液细叶远志皂苷含量测定 1)色谱条件：色谱柱为Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇-0.05%磷酸溶液(62∶38)为流动相；检测波长为210 nm；流速为1.0 mL/min；进样体积为10 μL。2)对照品溶液制备：打开1/10万天平，预热稳定30 min，取洁净的10 mL容量瓶放进电子天平，待读数稳定后调零，加入国家药品标准物质细叶远志皂苷适量，记录好称量数据，加色谱甲醇超声使溶解并定容制成0.840 g/L的溶液，再精密吸取适量加色谱甲醇稀释至浓度为每mL含0.420 mg的溶液，即得。3)供试品溶液制备：精密量取摇匀的远志橙皮口服液20 mL置圆底烧瓶中，蒸干，冷至室温，加入10%NaOH溶液20 mL于容器中，用电热套加热回流2 h， 冷至室温，用滴液管加入HCl试液，摇匀，用洁净棉签另一端浸蘸试液在精密试纸(pH 0.5～5.0)上，待试纸显色在pH值4.0～5.0后，每次用20 mL水饱和正丁醇振摇提取3次，分取正丁醇液，蒸干，放至室温，加色谱甲醇分次溶解洗脱并转移至10 mL棕色容量瓶中定容，摇匀，即得。4)阴性对照溶液制备：取缺远志酊的阴性样品(按照远志橙皮口服液工艺制备)，按“1.2.1.3)”项下同一方法制备，即得。

1.2.2 远志橙皮口服液橙皮苷含量测定 1)色谱条件：色谱柱为Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇-0.1%醋酸溶液(37∶63)为流动相；检测波长为284 nm；流速为1.0 mL/min；进样量体积为10 μL。2)对照品溶液制备：打开1/10万天平，预热稳定30 min，取洁净的10 mL容量瓶放进电子天平，待读数稳定后调零，加入国家药品标准物质橙皮苷适量，记录好称量数据，加色谱甲醇超声使其溶解并定容制成浓度为0.200 2 g/L溶液，再精密吸取适量加色谱甲醇稀释至浓度为4.0 mg/L溶液，即得。3)供试品溶液制备：用计量检定合格的单刻度胖度移液管吸取摇匀的远志橙皮口服液10 mL，加入计量检定合格的25 mL棕色容量瓶中，加色谱甲醇至刻度线，超声10 min， 静置5 min，取上清液，即得。4)阴性对照溶液制备：取缺橙皮酊的阴性样品(按照远志橙皮口服液工艺制备)，按“1.2.2.3)”项下方法制备，即得。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件分别对3批远志橙皮口服液中细叶远志皂苷和橙皮苷的含量结果数据进行单因素方差分析检验；标准曲线线性回归方程及其他描述性分析(均值及相对标准偏差RSD%)采用Excel软件处理，RSD%值应符合《中国药典》2015年版四部药品质量标准分析方法验证指导原则相关要求。检验水准α除特别说明外均设定为0.05。

2 结果

2.1 远志橙皮口服液细叶远志皂苷含量测定

2.1.1 专属性实验 按“1.2.1.1)”项下色谱条件测定结果显示供试品色谱中的细叶远志皂苷色谱峰与其他成分色谱峰达到基线分离，且缺远志酊阴性对照色谱图中相应位置未出现细叶远志皂苷干扰色谱峰(图1)。

图1 细叶远志皂苷对照品(A)、供试品(B)、阴性样品(C)HPLC图

2.1.2 线性关系考察 分别自动吸取浓度为0.840、 0.630、0.504、0.420、0.336、0.210和0.042 g/L的细叶远志皂苷对照品溶液各10 μL，按“1.2.1.1)”项下色谱条件测定其峰面积，通过Excel软件得到回归方程为A=3 112.7C-0.142 9，r=0.999 9 (n=7)。结果表明，细叶远志皂苷进样浓度在0.042～0.840 g/L呈良好线性关系。

2.1.3 精密度试验 细叶远志皂苷对照品溶液连续6次进样测得的峰面积RSD为0.48%，表明仪器进样精密度良好。

2.1.4 重复性试验 取6份远志橙皮口服液(批号：150506-S2)，平行测定每一份样品的细叶远志皂苷含量，通过Excel软件计算平均含量为0.165 3 g/L，RSD为0.57%，表明该方法重复性良好。

2.1.5 稳定性试验 分别于0、1、4、8、12和24 h测定重复性项下同一供试品溶液中细叶远志皂苷峰面积的RSD为0.82%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.6 回收率试验 取摇匀的远志橙皮口服液(批号：150506-S2)，精密量取10 mL，共9份。前3份按80%比例、中间3份按100%比例、后3份按120%比例分别精密加入国家药品标准物质细叶远志皂苷适量，加水补足至20 mL，按“1.2.1”项下含量测定方法测定其含量，通过Excel软件计算细叶远志皂苷的回收率，其平均加样回收率为101.12%，RSD为1.14%(表1)。

表1 远志橙皮口服液中细叶远志皂苷加样回收率试验结果(n=9)

2.1.7 含量测定 取本品3批，每批各3份，摇匀，按“1.2.1”项下细叶远志皂苷含量测定方法测定其含量，结果显示3批远志橙皮口服液中细叶远志皂苷含量比较，差异无统计学意义(P>0.05)(表2)。

表2 3批远志橙皮口服液中细叶远志皂苷的含量测定结果(n=3)

2.2 远志橙皮口服液中橙皮苷含量测定

2.2.1 专属性试验 按“1.2.2.1)”项下色谱条件分别对“1.2.2.2)、1.2.2.3)、1.2.2.4)”项下溶液进行测定，在该色谱条件下，缺橙皮酊阴性样品在橙皮苷对照品色谱峰位置无阴性干扰，供试品溶液色谱中的橙皮苷色谱峰与其他成分色谱峰达到良好的基线分离(图2)。

图2 橙皮苷对照品(A)、供试品(B)、阴性对照(C)HPLC图

2.2.2 线性关系考察 分别自动吸取10 μL浓度为0.6、1.0、2.0、4.0、8.0、20.0、40.0 mg/L的橙皮苷对照品溶液，按“1.2.2.1)”项下色谱条件测定其峰面积，通过Excel软件得到回归方程为A=35.159C-1.292 4，r= 0.999 9(n=7)。结果显示橙皮苷在浓度为0.6～40.0 mg/L具有良好线性关系。

2.2.3 精密度试验 连续6次自动进样测定同一橙皮苷对照品溶液的峰面积RSD为0.37%，表明仪器进样精密度良好。

2.2.4 重复性试验 取6份远志橙皮口服液(批号：150506-S2)，平行测定每份样品的橙皮苷含量，通过Excel软件计算平均含量为4.95 mg/L，RSD为0.65%，表明该方法重复性良好。

2.2.5 稳定性试验 分别于0、1、4、8、12和24 h对重复性项下供试品溶液测定橙皮苷峰面积的RSD为0.70%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.6 回收率试验 取摇匀的远志橙皮口服液(橙皮苷含量为4.95 mg/L)，精密量取5 mL，共9份。前3份按80%比例、中间3份按100%比例和后3份按120%比例分别精密加入国家标准物质橙皮苷适量，加水补足至10 mL，按“1.2.2”项下橙皮苷测定方法测定其含量，橙皮苷的平均加样回收率为101.93%，RSD为1.03%(表3)。

表3 远志橙皮口服液中橙皮苷加样回收率试验结果(n=9)

2.2.7 含量测定 按前述橙皮苷含量测定方法，分别对连续3批远志橙皮口服液(每批随机抽取3份样品)进行含量测定，测定结果采用方差分析，结果显示3批远志橙皮口服液中橙皮苷含量比较，差异无统计学意义(P>0.05)(表4)。

表4 3批远志橙皮口服液中橙皮苷含量测定结果(n=3)

3 讨论

远志酊是远志流浸膏加60%乙醇混合后去除沉淀杂质制成的酊剂，其主要有效成分为具有祛痰、镇咳、抑菌等作用的远志皂苷类化合物，但此类化合物不稳定，可经过碱水解转化为稳定的“细叶远志皂苷”[5-6]。橙皮酊是以橙皮为原料加60%乙醇采用渗漉法提取制成，其主要有效成分中橙皮苷含量最高。大量研究[7-8]发现，橙皮苷具有祛咳平喘、抗炎等功效。研究[2,9]表明，含远志酊和橙皮酊的制剂均相应以细叶远志皂苷和橙皮苷为该制剂质量控制的指标性成分，因此本实验通过测定细叶远志皂苷和橙皮苷的含量来控制成品的质量。

细叶远志皂苷流动相主要以乙腈-0.1%磷酸水溶液和甲醇-0.05%磷酸水溶液两流动相系统为主[9-10]，因前者乙腈毒性大、成本高，故本实验主要选择后者进行了70∶30，65∶35，62∶38筛选。结果显示前两个比例的流动相细叶远志皂苷峰在分离度、理论塔板数等指标方面均不及后者，故确定细叶远志皂苷含量测定的流动相最佳条件为甲醇-0.05%磷酸水溶液(62∶38)。橙皮苷流动相主要以甲醇-水和甲醇-冰醋酸-水系统为主[11]，最初以简单的甲醇-水系统试验发现橙皮苷峰形拖尾严重，分离效果不佳，最终以甲醇-冰醋酸-水系统为基础筛选以甲醇-0.1%醋酸溶液(37∶63)作为橙皮苷含量测定的流动相最佳条件。

在制备细叶远志皂苷供试品溶液中涉及到样品挥干的操作中，因水浴加热挥发太慢，影响操作时间，采用电热套加热，但在加热过程中容器壁容易糊化，需注意温度的把握，同时在加热的同时轻轻摇动容器，将附在壁上的残渣洗到未挥干的液体中，待液体快全部挥干时，关闭电热套，并及时移走，以免残渣糊化，影响含量结果；在制备橙皮苷供试品溶液中涉及到样品加入甲醇的操作中，操作时应边振摇边缓缓加入甲醇，避免橙皮苷被包裹在甲醇沉淀物中，影响含测结果。

综上所述，本实验以细叶远志皂苷和橙皮苷为指标建立的含量测定方法稳定、可靠，对进一步完善远志橙皮口服液的质量控制具有一定的参考价值。但本研究尚有不足之处：细叶远志皂苷供试品溶液制备方法步骤相当繁杂，每个操作环节专注度要求极高，因此对操作者经验要求较高；含量测定指标性成分较少，不能充分控制反映制剂有效性和安全性的有效成分含量及比例变化；不同的指标成分用不同的色谱条件，增加了质量检测成本，耗时长。在后续研究工作中，尝试同时测定本制剂多种反映其内部质量成分的含量，简化供试品溶液制备方法，节约检测时间和检验成本；同时探索建立该制剂的指纹图谱，更精准控制药品的有效成分含量及比例变化。