家畜产气荚膜梭菌病的诊断与防治

朱 波，张梅梅，祖新政，赵俊亮*，王登峰

（1.新疆呼图壁种牛场有限公司，新疆 呼图壁县 831100；2.新疆畜牧科学院兽医研究所（新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心），乌鲁木齐 830000）

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)，旧称魏氏梭菌，是一种广泛分布于水源、土壤等自然界以及动物肠道中的条件致病性细菌，该菌环境耐受性强、致病因子多种多样，常导致人和多种家畜发生不同临床症状的疾病，如：人气性坏疽、食物中毒，牛羊猝死综合症、羊肠毒血症、牛肠道出血综合症、羔羊痢疾、仔猪红痢、禽坏死性肠炎等[1]。由于产气荚膜梭菌的导致的疾病发病急、病程短、病死率高，它的流行常给家畜养殖业造成严重的经济损失[2]。自20世纪80年代以来，国内一些研究单位成功研制了产气荚膜梭菌多价灭活疫苗，为该病的有效防治做出了重要贡献。但近年来，即使在一些免疫畜群，仍然出现产气荚膜梭菌的感染，如何有效防控该病成为当前家畜养殖业可否健康发展的障碍之一。有鉴于此，本文综述了产气荚膜梭菌诊断和检测方法，并从疫苗预防和抗生素治疗等方面进行防治技术方面总结，为基层临床兽医提供该病的预防和治疗参考资料。

1 实验室诊断

败血症型产气荚膜梭菌感染的诊断相对简单，根据死亡动物的临床症状、剖检病理变化（主要表现为败血症的临床症状和剖检病理变化）和显微镜检查、直接涂片的革兰氏染色和细菌培养可以做初步诊断，其中，产气荚膜梭菌在动物死亡后获得的病变或病理组织中被检出，可以确定其可能是致病因素；但大肠杆菌等其他细菌也可以引起动物败血症死亡，动物死亡后，产气荚膜梭菌可快速侵入，此时检出该菌就不能确定其为致病菌，需要进行血清中和试验进行确诊。

1.1 病原学诊断

细菌的分离培养和鉴定是进行细菌性传染病确诊的常用诊断方法。根据感染疾病临床特征、革兰氏染色特性、细菌形态和生化特性可以对该类细菌的感染做出初步诊断[3]。产气荚膜梭菌常规生化鉴定通常采用糖发酵试验、七叶苷水解试验、产吲哚试验、硝酸盐还原试验、明胶水解试验、乳蛋白水解试验中的“暴烈”发酵反应等[4]。此外，基于气相-液相色谱对代谢产物短链脂肪酸的分析同样用于产气荚膜梭菌的鉴定，挥发性脂肪酸色谱分析显示，产气荚膜梭菌产乙酸、丙酸、丁酸[5]，部分菌株也可产琥珀酸和乳酸[6]，但该方法尚不能进行亚型（如毒素型）区分，且费时费力、检测成本高等难以广泛应用于临床检测。

随着微生物及传染病研究的深入，对微生物进行型、亚型、株乃至分子水平上的鉴定显得极为重要。分子生物学理论和技术在传染病检测与诊断中的广泛应用，使得细菌鉴定更加准确、快捷和经济节约。当前，用于产气荚膜梭病诊断的技术主要有聚合酶链式反应（PCR）技术、16S rRNA序列测定和同源分析技术、核酸探针技术等。

1.1.1 PCR技术

依据产气荚膜梭菌α毒素、β毒素、ε毒素和ι毒素的型特异基因发展而来的多重PCR方法广泛应用于产气荚膜梭菌毒素型的鉴定[7,8]。同时，还可以根据生产和研究需要，设计特异PCR引物用于特定来源菌株的鉴定，如对粪便样本中肠毒性产气荚膜梭菌的鉴定等[9]。由于该方法具有快捷、简便、易操作等优点，已取代血清中和试验用于产气荚膜梭菌的毒素分型。

1.1.2 16S rRNA序列测定和同源分析技术

16S rRNA是病原菌检测和鉴定的一种强有力工具，可以实现对病原菌进行快速、微量、准确地分类鉴定。根据GenBank公布的产气荚膜梭菌16S rRNA序列分析发现，产气荚膜梭菌种间16S rRNA同源性达到了99.8%以上，表现高度保守，目前多对国际通用细菌16S rRNA PCR扩增引物可供选择，测序通过获得16S rRNA序列可以快速准确地进行种的鉴定[10]。Smith等人利用该方法扩增16S rRNA片段、测序并在NCBI网站BLAST搜索后，与已知产气荚膜梭菌16S rRNA序列相似性为100%，确定为产气荚膜梭菌[11]。与传统生化鉴定方法，该方法较为快捷、准确地给出试验结果，减少了试验环节操作不当或失误造成的结果误判。

1.1.3 核酸探针技术

Van Damme-Jongsten[12]等人报道了用32P标记探针检测食物中毒样品中的肠毒性产气荚膜梭菌的研究；我国杜蔷等人[13]建立了基于地高辛标记的肠毒素特异性基因原位杂交检测方法，该方法不仅具有较高的敏感性和特异性，同时还克服了32P标记探针的放射污染的问题。

1.1.4 SDS-PAGE技术

SDS-PAGE技术是利用聚丙烯酰胺凝胶的分子筛效应，根据不同毒素型菌株所产生的主要毒素蛋白相对分子质量、形状及其所带电荷量的差异实现对其梯度分开，进而根据菌株含有的主要毒素进行毒素分型。于晓霞等[14]建立了SDS-PAGE毒素分型方法，并开展了临床分离株的分型调查，其检测结果与多重PCR检测结果具有较高的一致性。虽然该方法较为简单快捷，但由于不同菌株分泌毒素能力存在一定差异，菌液上清毒素处理是确保检测结果可靠性的关键，因此还有待更多试验数据予以验证。

1.1.5 基因芯片技术

基因芯片又称DNA微阵列(DNA microarray)，是采用原位合成或直接点样的方法将DNA片段或寡核苷酸片段排列在基片表面形成微矩阵，待检样品用同位素或荧光分子标记后，与微矩阵上探针通过DNA-DNA碱基配对杂交，经过扫描及计算机分析即可获得样品中大量的基因序列及表达信息，达到敏感、高通量、特异性地分析生物信息的目的[15]。赵渝徽[16]利用该技术成功构建了压电石英晶体传感器产气荚膜梭菌基因芯片检测系统，能够有效检测产气荚膜梭菌的毒素基因并能分型鉴定三种产气荚膜梭菌毒素。

1.2 血清学诊断

产气荚膜梭菌感染的血清型诊断主要有血清中和试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)，它们可应用于感染菌株的血清型鉴定或所产毒素的定型，也可用于感染菌株的血清抗体水平检测。

1.2.1 血清中和试验

血清中和试验是评价产气荚膜梭菌毒素效价和毒素分型的经典方法，广泛用于疫苗效果评价和菌株分型鉴定。该方法把产气荚膜梭菌培养上清毒素、培养上清毒素与抗血清中和后混合物接种小鼠或豚鼠，通过观察小鼠是否被保护，豚鼠皮肤是否发生坏死等临床指标进行判定。由于体外培养的ε毒素、ι毒素以原毒素形式存在于上清中，需经胰蛋白酶等酶激活后才具有毒素活性；并且，毒素分型试验中需要多次中和试验才能判定结果，导致该方法费时费力且耗费较高，并不利于临床实际操作[17,18]。当前，广泛建立的ELISA和PCR方法可解决上述不足。

1.2.2 酶联免疫吸附试验

ELISA诊断方法具有快速、简便、特异、敏感和高通量的检测特点，澳大利亚Uzal等人[19]建立了间接 ELISA（Indirect ELISA）和竞争 ELISA（competitive ELISA）方法用于评价 ε毒素抗血清效价，两种ELISA方法与小鼠血清中和试验关联系数分别为0.99、0.98，结果基本一致。McCourt等人[20]报告了夹心EILSA（Sandwich ELISA）用于产气荚膜梭菌坏死性肠炎的诊断，诊断结果也与商品化夹心ELISA诊断试剂盒检测结果相同。国内也有研究人员报道用间接ELISA和斑点ELISA（dot-ELISA）进行肠毒血症诊断的研究[21,22]，也取得了较好结果。但由于产气荚膜梭菌不同血清型菌株所产毒素种类复杂多样，使得产气荚膜梭菌病的ELISA诊断与检测在我国尚处在试验研究阶段。

2 防 治

产气荚膜梭菌是肠道菌群的一部分，外界环境的突然变化或其它应激破坏动物肠道菌群的稳态，从而导致梭菌的快速、大量繁殖，释放的毒素导致疾病的暴发。该病发病急、病程短且死率高，故防治中以免疫预防为主；同时，减少抗生素的使用和应激防止动物肠道菌群的失衡在预防该病中也有积极作用。此外，维持肠道稳态、克服外界刺激的益生菌等微生态制剂可能有一定的预防作用。发病后，及时发现并在发病早期使用抗生素治疗可能会降低损失。

2.1 免疫预防

目前，灭活疫苗是预防产气荚膜梭菌性疾病的主要有效方法。制苗菌株一般选择一定区域内优势毒素型菌株，通过发酵生产外泌毒素，经甲醛等方法灭活后加佐剂制备成类毒素疫苗。国内常见的疫苗有以腐败梭菌和产气荚膜梭菌C型（或B型）、D型菌种制备的预防羊快疫、羊猝狙、肠毒血症和羔羊痢疾的三联四防疫苗和经工艺改良的三联四防疫浓缩苗。这类疫苗已经商业化生产并广泛应用绵羊梭菌病的防治。除此之外，我国王克领、薛家宾等人分别研制出了兔出血症-魏氏梭菌病-巴氏杆菌病三联苗[23,24]；赵立峰用本地分离的鹿源产气荚膜梭菌研制出鹿出血性肠炎疫苗[25]。

在国外，家畜产气荚膜梭菌病免疫也是牛羊免疫程序中的重要组成部分，如用于预防牛羊肠毒血症和梭菌性肠炎的UltrabacRCD疫苗，为产气荚膜梭菌C型和D型菌苗-类毒素疫苗；用于家畜多种梭菌病免疫预防的Ultrabac8疫苗，为肖韦梭菌-腐败梭菌-溶血梭菌-诺维梭菌-污泥梭菌-C型和D型产气荚膜梭菌疫苗，和Ultrabac7/Somubac疫苗，为肖韦梭菌-腐败梭菌-诺维梭菌-污泥梭菌-C型和D型产气荚膜梭菌疫苗；Scourguard4KC为牛轮状病毒-冠状病毒灭活苗-C型产气荚膜梭菌-大肠杆菌菌苗-类毒素疫苗，用于预防健康和妊娠牛群腹泻病；C型产气荚膜梭菌-大肠杆菌菌苗-类毒素疫苗（Scourmune-C）用于预防猪的大肠杆菌病和梭菌性肠毒血症。

2.2 抗生素的治疗

虽然产气荚膜梭菌所引起的疫病发病急，死亡快，但在发病初期（尚未大量产生毒素阶段），采用敏感抗生素进行治疗，仍可取得一定的治疗效果。根据产气荚膜梭菌的耐药基因检测、序列分析和临床的应用，临床分离株普遍对青霉素G、头孢菌素、四环素、氯霉素、盐霉素、莫能菌素、呋喃唑酮、利福平、杆菌肽、卡巴多、红霉素、林可霉素、克林霉素、氨丙啉、双呋脒腙和维吉尼亚霉素敏感，但对黄霉素和氨基糖苷类抗生素有抵抗力[26,28]。但也有报道称从猪和家禽分离的一些菌株对四环素、杆菌肽、维吉尼亚霉素、大环内酯-林可酰胺类（macrolide-lincosamide）抗生素和其他用于促进生长和预防疾病的抗菌剂具有获得性耐药性[28]，并有一项研究报道称来自家畜的大多数菌株对链霉素、红霉素、头孢菌素、林可霉素、四环素、杆菌肽和羧苄青霉素有抵抗力，甚至有超过15%的分离株对青霉素有抵抗力[28]。因此，根据当地流行菌株耐药状况，选择敏感类抗生素进行该病的早期治疗，可能会降低产气荚膜梭菌病造成的损失。

此外，维护动物肠道菌群的稳态可减少梭菌病的发生。益生菌在维持肠道稳态、克服外界刺激、抵御产气荚膜梭菌病感染中可发挥重要作用[27]。Teo等人[29]等从健康鸡胃肠道筛选到一株新型枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），该菌可分泌一种抗梭菌因子，能够有效抑制产气荚膜梭菌在内的多种细菌的生长繁殖。该项研究也为产气荚膜梭菌的生物防治提供了可能。

3 结 语

产气荚膜梭菌的感染是近年来家畜养殖业中的流行较广、死亡率较高的疫病之一。虽然传统的类毒素疫苗在防治中发挥着重要作用，但由于长期高密度的免疫，由疫苗毒株所覆盖的产气荚膜梭菌毒素得到了较好的控制，近年来，由于毒力因子的水平转移及其新毒素的发现，使得该菌引起或继发的感染有所加重。此外，产气荚膜梭菌作为一种条件性致病菌，饲养方式、饲草料结构以及气候条件的突然改变，都提高了产气荚膜梭菌病流行的风险。在当前形势下，传统疫苗广泛代表性菌株的筛选、新型高效疫苗的研制以及抗产气荚膜梭菌新型靶标药物的开发仍是未来防治该病的重要措施之一。在采用疫苗、药物进行防治的同时，细化日常管理、保持良好的饲养环境、维持饲草料结构的平衡也是有效防控该病的主要措施。只有通过营养、日常管理、合理药物使用与高效疫苗的研发等综合措施，才能有效预防产气荚膜梭菌的感染、降低该病的发病率，从而有利于家畜养殖业的健康发展。