G蛋白偶联受体的研究进展＊

李聪慧，崔诗遥，顾燕燕，解鸿青，屠振力，时连根

（浙江大学 动物科学学院，浙江 杭州 310058）

1 G蛋白偶联受体的特性与种类

1.1 G蛋白偶联受体的特性

G蛋白偶联受体（G protein coupled receptor，GPCRs）是一类高度保守、存在于细胞表面的膜蛋白超级家族，其数目和种类在细胞表面受体中为最多。在从低等真菌到高等哺乳动物的生物体中，广泛存在有GPCR，它通过与G蛋白的偶合来调节胞内相关酶的活性，以此产生第二信使而将配体信号从胞外跨膜传递到胞内，使细胞的功能活性发生改变，最终对生物体的生长发育、生殖、滞育、摄食、代谢以及行为等起到调控作用。

GPCR由一条肽链组成，包含七个α螺旋跨膜结构域，这七个α螺旋跨膜结构域将受体分割为胞外N端、3个胞外环、胞内C端和3个胞内环。受体的胞外部分常带有糖基化修饰，胞外环上存在的两个高度保守的半胱氨酸残基，可以通过形成二硫键对受体空间结构起稳定作用。在受体的C端和连接（从肽链N端数起）第5和6个跨膜螺旋的胞内环（第3个胞内环）上，都有与G蛋白、GRKs、arrestin等下游信号分子结合的位点［1］。

1.2 G蛋白偶联受体的分类

根据GPCR氨基酸序列的保守性及结构特征，将GPCRs分为如下4个亚家族［2］：

1.2.1 A族受体

是目前已发现的最大的一类GPCR，含有大量的保守氨基酸，且在第一、二个胞外环之间由二硫桥连接。大多数受体的C端尾含有棕榈酰化的半胱氨酸（Cys），锚定于膜上。它的配体主要有生物氨基酸及核苷、多肽等。此类受体包括神经肽受体、视觉色素受体等。

1.2.2 B族受体

有相对长的氨基端，含有一些Cys位点，可以形成二硫键，形态类似于A族受体，但不含棕榈酰化位点。主要配体有降钙素、胰高血糖素、副甲状腺素、利尿素等。

1.2.3 C族受体

有长的氨基端及羧基端，除ECL1、ECL2的两个亮氨酸形成二硫桥结构外，C族受体不含A、B族受体的特征。主要包括谷氨酸盐受体、γ-氨基丁酸受体、Ca2+受体等。

1.2.4 F/TAS族受体

N端较长，结合Wnt糖蛋白。此类受体主要是味觉受体。

2 G蛋白偶联受体的信号转导机制

经典理论认为，GPCR被配体激活后，构象发生变化，然后与一种特异的三聚体G蛋白相偶联。三聚体G蛋白由α、β、γ亚基组成，活化受体使得与α亚基结合的GDP转化为GTP，并导致α亚基与β、γ亚基分离，受体偶联的Gα以及分离的Gβ、Gγ分别引发不同的胞内效应体系，从而传导配体信号。信号传导结束后，α亚基上的GTP酶水解GTP为GDP，α亚基重新与β、γ亚基亲和形成三聚体G蛋白，复位等待下次信号转导［3］。Gα是信号传导过程中重要的一环，Gβ、Gγ主要参与下游的信号调节［4，5］。

配体和受体结合后所引发的胞内效应体系主要有以下3种：

2.1 PKA途径

活化后的Gα（Gαs/Gαi/o）调节细胞膜上的CA（Adenylate Cyclase，腺苷酸环化酶）活性，活化/抑制胞内ATP（Adenosine Triphosphate，三磷酸腺苷）转化为 cAMP（Cyclic Adenosine Monophosphate，环磷酸腺苷），cAMP作为胞内第二信使物质，调节cAMP依赖的PKA（Protein Kinase A，蛋白激酶A）活性，接着采用磷酸化/去磷酸化的方式，对生物代谢通路、基因表达等多种效应机制进行调控［6］。

2.2 PLC途径

活化的Gα（Gαq）与膜上的肌醇PLC（Phospholi⁃pase C，磷脂酶C）偶联，催化pIp2（Phosphatidylinosi⁃tol diphosphate，磷脂酰肌醇二磷酸）水解产生IP3（Inositol trisphosphate，三磷酸肌醇）和DAG（Diacyl⁃glycerol，甘油二酯）。IP3与细胞内质网上的IP3受体结合，打开Ca2+通路，使内质网中的Ca2+释放到胞浆中，Ca2+也作为胞内第二信使物质，调节胞内各种酶的活性。DAG则与Ca2+以及结合在细胞膜内侧的磷脂一起，激活PKC（Protein Kinase C，蛋白激酶C），PKC激活胞浆中的促有丝分裂蛋白激酶，参与下游的信号调节［7］。

2.3 受体门控离子通道途径

活化的Gα（多为Gαi/Gαo）导致内向整流K+（GIRKs）通道开放，或抑制电压门控Ca2+通道。同时，Gβ、Gγ也参与GIRK通道的相关活化［8］。

GPCR的活性可以通过脱敏、复敏等来调节。受体脱敏的经典模型主要包括三种机制：受体在蛋白激酶作用下磷酸化后，与其相应的G蛋白不匹配；β-arrestin、GRK介导的质/膜受体内化；受体mRNA含量下降，通过减少合成量及降解已有受体的方法来导致胞内受体组成下降。失活的受体也可通过去磷酸化、溶酶体内加工等方式复敏，重新定位于膜上［9］。

3 G蛋白偶联受体用于药物作用靶标

GPCR是跨膜蛋白受体的一个大家族，目前已发现涉及感觉、化学、刺激等成员800多个。在生长、发育、生殖、滞育、神经、精神等生命活动以及内分泌、代谢等生理过程中均有GPCR参与，同时糖尿病、心脏病、肿瘤、免疫与感染性疾病、神经与精神性疾病等的发生、发展、治疗效果也与GPCR密切相关。为此，GPCRs成为了当前最为重要的药物作用靶标库。根据最新的统计数据，美国食品样品监督管理局（FDA）批准上市的药物中共有475种药物靶向GPCRs，约占FDA批准药物的34%；2011～2015年间，GPCRs药物销售额达9170亿美元，销售份额占全球总额的约27%；统计获批药物和临床候选药物作用靶点时，发现胺类受体如组胺受体、多巴胺受体、肾上腺受体、乙酰胆碱受体等为最大的药物靶点，475种获批药物中的314种作用在该类受体上。

目前新药开发的主要思路是筛选能抑制有害信号传递的物质，例如：治疗慢性心脏衰竭的Meto⁃prdol是一个针对β1视紫质的反激动剂，治疗神经分裂症的Clozapine是一种反激动剂［2］。药物开发过程往往从一个与疾病相关的GPCR入手，寻找该通路的一些阻断、激活分子，即找到新受体及其与疾病的关系，是开发新药的先决条件。然而，由于有很多的代偿途径同时存在于人体内，并且某个生理效应可以由不同的受体所引发，所以将GPCR与疾病匹配还有许多难题。此外，虽然体外实验积累了大量的数据，但是药物作用的是一个复杂的机体，需要有体内实验的可靠证据才可以投入使用，同时需要大量的动物缺失突变的模型来证实GPCR与疾病的关系［10］。

4 G蛋白偶联受体研究的热点

4.1 G蛋白偶联受体功能筛选平台

利用生物信息学的手段对日益充实完善的基因组数据库进行分析，再以分子生物学方法克隆出许多GPCR基因，但为其匹配的相应激动剂、拮抗剂的研究相对滞后。目前已经建立的激动剂、拮抗剂筛选平台主要有以下几种［11］：

4.1.1 鸟苷酸结合实验

该平台用于检测在激动剂作用下与膜上GPCR结合的［35S］GTPγS。Larsen等用此方法在CHO细胞系上鉴定了果蝇中的两个Allatostatin受体（DAR-1和DAR-2）［12］。该平台的优点是：位于信号传导途径的上游，干扰因素较少。缺陷是：只对Gαi/o偶联的受体比较灵敏，原因是该类受体GTP/GDP变化最快，量最大；实验要求分离自由态/结合态的［35S］GTPγS，具有放射性的危险。

4.1.2 cAMP实验

该平台基于对整个细胞内cAMP的测量以及细胞膜上腺苷酸环化酶活力的测定，比较适用于Gαs偶联的受体，但对于Gαi/o偶联的受体需要用福斯高林（一种腺苷酸环化酶激活剂）进行预处理。Beggs等利用这种方法鉴定了一个从蜜蜂中克隆到的D1型多巴胺受体，发现其有组成型活性［13］。

4.1.3 磷酸肌醇（IP）累积实验

该平台适用于Gαq偶联的GPCR的筛选。之前有利用IP3结合蛋白来测定IP3含量的模型，尽管此方法孵育时间短，但信/噪比高。所以，目前人们用IP1抗体来检测IP1的累积。Trinquet等建立了一种基于D-myo-inositol 1 monophosphate的HTRF模型，与IP模型、Ca2+迁移模型比较，证明该模型是可行的［14］。

4.1.4 胞内Ca2+实验

GPCR信号传递过程中往往伴随着Ca2+的迁移，该平台基于这种现象而建立。如水母发光蛋白在腔肠素存在时，能通过发荧光指示胞内Ca2+的浓度变化。Radford等利用这个原理，在S2细胞中表达水母发光蛋白的读码框，检测到Anopheles中白细胞激肽的受体［15］。随着高通量检测技术的发展，使用Ca2+敏感性染料，以实时电偶仪（CCD）为基础的荧光板阅读器（FLIPR），自动完成对Ca2+积累、胞外Ca2+进入、内质网Ca2+释放的测量［16］。

4.1.5 报告基因表达实验

该平台是利用活化的第二信使激活报告基因的启动子来进行检测的，目前被利用的报告基因有β-半乳糖苷酶、荧光素酶、绿色荧光蛋白等。Hearn等用荧光素酶报告基因的方法，鉴定了一种多选择性剪切的果蝇多巴胺型受体［17］。尽管已有1536孔自动检测仪用于检测目的基因的表达，但该平台的处理时间较长，并且对下游产物的检测易产生假阳性现象。

4.2 G蛋白偶联受体的非放射性实验

虽然放射性标记的灵敏度高，但存在放射性的危险。因此，人们尝试着将放射性标记更换为荧光标记。通过荧光标记技术对受体进行实时的胞内定量、定位分析、结构解析等，是当前研究的热点之一。但荧光标记有可能改变信号分子受体的药理学效果，使体外实验不能反映出体内的实际情形。同时，异源表达也可能会引发表达水平低、缺少互作蛋白、重复性低等许多问题。为此，建立起高通量、不含放射性、快速、精确、全面的筛选模型，是当前药物筛选开发的一个重要研究目标。

4.3 G蛋白偶联受体二聚化现象

GPCR尤其是结构相似的GPCR，其异源二聚化现象很常见，例如C族GABAR88与味觉受体二聚化，B族降钙素受体样受体与RAMP二聚化等。二聚化可能改变受体的药理学特性，例A族共表达的δ、μ-阿片受体，使得它们不能与任一单一配体结合，但在两种配体同时加入时引发了强烈的阳性反应。有学者认为，受体二聚化可能是GPCR与三聚体G蛋白偶联的条件。但也有学者认为，受体二聚化可能是体外实验时受体在细胞中过表达所形成的假象［2］。

新兴技术BRET（生物发光共振能量转移）和FRET（荧光团共振能量转移），已经被用于受体二聚化问题的研究。该二项技术的原理是：当两种物质的距离足够接近时，部分能量（荧光能/生物光能）能从供体转移给受体。FRET依赖外源光的激发，BRET的供体荧光是荧光素酶氧化底物而发生的，均可用于考察蛋白质间的相互作用，被广泛地应用于GPCR的二聚化研究领域［18］。Berthouze等利用BRET技术，发现5HT4受体的TM3与TM4间形成二硫桥的两个Cys位点对其同源二聚化非常重要［27］。Hamdan等用BRET技术检验12种GPCR内吞时，发现10种受体发生了β-arrestin与β2-adaptin的结合［19］。

4.4 G蛋白偶联受体的结构研究

分析已解析的GPCR二级结构，可以将GPCR蛋白分子划分成3部分：①胞外区，包含N端和3段胞外环区；②跨膜区，包含7段跨膜α螺旋；③胞内区，包含3段胞内环区、胞内第8根螺旋和羧基端（C端）。胞外区域负责识别信号分子，跨膜区形成整个蛋白的骨架并负责结合配体、传递信号，胞内部分与G蛋白、GRKs、arrestin等下游效应分子结合以传递信号。GPCR的三维结构解析，对于理解GPCR的信号转导机制和基于其结构的药物设计具有十分重要的意义。但GPCR是跨膜蛋白，因此不易得到晶体，难以用X射线、NMR等方法测定其三维结构。所以直到2000年才由Palczewski等从天然组织中提取牛视紫红质蛋白，与11-顺式-视黄醛复合后得到复合晶体，从而解析出第1个GPCR的三维精细结构［20］。当前获得高质量GPCR蛋白晶体的方法主要有三种：缺失（或点）突变法、融合蛋白法和盒式突变法。2007年Rosenbaum研究团队利用体外重组技术表达纯化了人β2肾上腺素受体，并采用缺失（或点）突变法结合融合蛋白法，将影响蛋白稳定性的氨基酸或氨基酸片断删除掉，同时将胞内第3个柔性loop与抗体Fc片断相融合，第一次获得了稳定的人β2肾上腺素受体晶体，从而解析出其3.7Å的精细结构［21，22］，该成果成为当年世界十大科技进展之一。Warnel等也采用点突变不稳定氨基酸以及缺失突变较长N末端、较长C末端、胞内loop，于2008年获得了稳定性高的火鸡β1肾上腺素受体突变体，并解析出其2.7Å的精细结构［23］。盒式突变法是将GPCR蛋白跨膜螺旋表面的多个疏水残基用亲水残基渐进式定点替换，以获得形态相似、功能相同、水溶性的GPCR蛋白突变体，从而进一步解析出其精细结构。盒式突变法目前还处于探索阶段，至今还没有用该方法成功解析出GPCR蛋白精细结构的结果报道。缺失（或点）突变法、融合蛋白法和盒式突变法均或多或少地改变了原始蛋白的一些结构，以此解析出的晶体结构可能与其实际结构存在一定的差别，但这并不会影响我们在更多了解GPCR蛋白结构与功能的关系中，获取重要、有用的参考资料。