上皮细胞间质转化促肺纤维化机制及药物干预治疗的研究进展*

王 源，李万成

成都医学院第一附属医院 呼吸内科 (成都 610500)

肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是各种间质性肺疾病(如过敏性肺炎、石棉沉着病、 肺淋巴平滑肌瘤病)的最终病理表现[1]。其中，上皮细胞间质转化(epithelial to mesenchyma transition，EMT)被认为在PF发生发展过程中发挥着重要作用[2]。EMT是指在特定的生理及病理条件下，上皮细胞失去极性，上皮细胞形态改变，上皮细胞标志物E-钙粘素(E-Cadherin)等丢失或表达下调，间质细胞标记物如α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表达上调，最终使得细胞黏附能力减弱，增殖和迁移能力增强[3]。在 PF病理过程中，EMT的发生发展受到多种细胞内信号转导通路的调控，多种抑制或逆转EMT的药物有利于改善PF，其有望成为PF药物治疗的重要研究方向。

1 EMT参与调控PF的相关信号通路

1.1 Wnt信号通路

目前，发现Wnt信号通路主要有3条传导途径，包括经典通路: Wnt /β-链蛋白(β-catenin)信号通路，非经典传导通路: Wnt /JNK 信号通路和Ca2+介导的Wnt /Ca2+途径[4]。 研究[5]发现，包括有Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a在内的19种Wnt蛋白，其中参与 Wnt经典信号通路的种类有 Wnt2、Wnt3、Wnt8b 等，而参与非经典信号通路的种类有Wnt6、Wnt7b、Wnt10a等。经典的Wnt/β-catenin信号通路是调控 EMT 发生发展的重要信号通路。其构成包括: 分泌蛋白Wnt家族，分泌型卷曲蛋白相关蛋白( secreted frizzled-related protein， sFRP) 、家族蛋白激酶 2A(protein phosphatase 2A，PP2A)、跨膜受体(Frizzled 家族分子 Fz)、酪蛋白激酶(casein kinase 1，CK1)、Dickkopf 蛋白( DKK) 家族、糖原合成酶激酶-3β( Gsk-3β)、β-catenin以及结肠腺瘤息肉蛋白 (adenomatous polyposis coli，APC)[6]。其调控机制为:1)当Wnt被激活时,Wnt受体Fz的胞外区与 Wnt 结合，通过下游信号传导，使得β-catenin 无法在细胞质中被降解，此时β-catenin作为运载体介导E-Cadherin与α-catenin 形成复合物，抑制E-Cadherin活性表达；2)积聚到一定程度后，β-catenin发生核转位，与核内转录因子(TCF /LEF) 形成复合物，激活下游靶基因如 Snail、Slug转录，进而促进 EMT 发生[7]；3)Wnt信号活化后，抑制GSK-3β活性，使得β-catenin分解减弱，高浓度的β-catenin将诱导细胞形态改变，从而调节EMT[8]。

1.2 Rho-Rock 信号通路

Rho-Rock 信号通路是机体各器官组织中普遍存在的一条信号转导通路。Rho家族蛋白具有三磷酸鸟苷 (guanosine triphosphate, GTP)酶活性，又称为Rho GTPase，属于Ras超家族中的GTP结合蛋白。在哺乳动物细胞内，存在有20余种不同Rho蛋白。Rho在细胞内与GDP/GTP结合态之间相互转化[9]。目前，研究[10]认为，Rho家族蛋白，通过介导细胞内信号通路，影响细胞骨架形成，改变细胞形态，影响细胞增殖、黏附能力，进而发挥其多种生物学效应。Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho associated coiled coil forming protein kinase，Rock)为Rho下游靶效应分子，接受Rho传递的活化信号，完成自身氨基酸结构域磷酸化改变，介导下游一系列磷酸化/脱磷酸化反应过程，从而影响细胞形态及功能。

1.3 TGF-β/Smads通路

TGF-β超家族包括25 种相关蛋白，主要包括 TGF-βs、活化素(activins)、抑制素(inhibins)、生长分化因子(growth differentiation factors，GDFs)等，在胚胎发育、细胞分裂、器官形成、组织修复等方面发挥重要作用。TGF-β为其中最重要亚型，在多种器官组织中表达，可由内皮细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、成纤维细胞等分泌，起着细胞分裂、增殖、分化、凋亡、迁移、刺激细胞外基质 (extracellular matrix, ECM)产生和促使ECM 降解等广泛的生物学作用[11]。

TGF-β受体( transforming growth factor-β receptor，TβR)广泛表达于各种组织中，TβR有3 种亚型(TGF-β1、TGF-β2 、TGF-β3型)，其中β1型和β2型为信号传递受体，其结构由膜外区、跨膜区和膜内区组成[12]。TβR膜外区均富含半胱氨酸[13]，被活化的TGF-β与TGF-β2结合后，磷酸化TβRI的甘氨酸-丝氨酸富集区域(GS序列)与配体结合，从而将生物信息向下游传导[14]。

Smad蛋白为 TGF-β 超家族转录协调因子，存在于细胞质当中，介导TGF-β 信号传导到细胞核。目前，研究[15]发现，细胞内存在有9 种Smads 蛋白，分为3大亚型：1)膜受体调控型 Smads(R-Smads)，包括有Smad1、Smad2、Smad3、Smad5 和 Smad8，其中 Smad2 和 Smad3 与 TGF-β1结合，形成转录复合体，与下游靶基因的特定部位结合，参与TGF-β 信号转导；2)共同通路型 Smads(Co-Smads)：Smad4、Smad10, 其中Smad4 与R-Smad 结合后形成异源复合物，进入细胞核参与调节转录；3)抑制型Smads(I-Smads)：Smad 6、Smad 7，对 TGF-β1 信号转导通路起负性调控作用。TGF-β 信号通路包括经典Smad信号通路和非经典Smad 信号通路。经典Smad信号通路是TGF-β发挥致纤维化作用的主要途径，TGF-β其他信号通路包括丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路、JNK、PI3K激酶等。经典Smad信号和非Smad信号转导之间相互作用影响。

2 抑制或逆转EMT为治疗靶点的药物

2.1 Wnt 通路抑制剂

Wnt 信号通路抑制剂在治疗PF中发挥重要作用，主要机制为阻断Wnt 信号通路激活及抑制下游信号通路的传导。Wnt 信号通路的抑制剂包括分泌蛋白家族 (the secreted frizzled related proteins，sFRp)、Wnt 抑制蛋白(wnt inhibitory protein，WIF)、Wnt ibitoryfactor-1(WIF-1)、Cerberus(CER)、Dickkopf(Dkk)蛋白家族。 Dkk-1 为 Dkk 蛋白家族中一员，是一种 LRP5/6 拮抗配体。Sun等[15]研究发现，Dkk-1 可以抑制 Wnt/β-catenin 信号传导通路，促使肺间充质干细胞向上皮细胞转化，修复受损的肺上皮细胞，延缓大鼠肺纤维化进程。依那西普是人源肿瘤坏死因子(TNF-α)拮抗剂，它被广泛用于风湿性疾病，是炎症因子靶点。动物模型研究[16]显示，给予依那西普干预后，与对照组相比，实验组小鼠Wnt1、Wnt3a、Wnt4表达下调，表明依那西普可以抑制PF进展。在博来霉素导致PF模型中，以马提尼是一种酪氨酸激酶抑制剂，可减少β-catenin表达，上调GSK-3β表达，从而抑制纤维化发生[17]。Tang等[18]研究吡非尼酮治疗PF，结果显示，治疗后肺间质炎症细胞计数下降，浸润面积缩小，肺泡灌洗液中IL-1 、SMA、Fn、FSP1 等标志物浓度下降，PF症状明显改善。

2.2 Rho-Rock 信号通路抑制剂

张冬梅等[19]研究结果显示，丹参酮ⅡA 可缓解 BLM 诱导的肺组织胶原蛋白沉积和M2型巨噬细胞浸润，增加肺组织上皮E-cadherin表达，降低肺成纤维细胞和肌成纤维细胞 Rho A、Rho C、Rock1水平，表明丹参酮ⅡA可通过阻断 Rock信号通路的活化，抑制肺纤维细胞增殖和活化，减少ECM沉积，缓解BLM所致的大鼠PF改变。此外，Jiang 等[20]通过建立BLM诱导PF模型发现，法舒地尔是一种人工合成的异喹啉磺胺衍生物,可通过抑制Rho/Rock信号通路的激活改善博来霉素导致的PF小鼠肺泡炎性渗出程度。解宏权[21]发现，TGF-β1诱导肺成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，体外培养细胞液中RhoA、RhoC、Rock1表达丰度增加，1型胶原、LN和FN大量沉积，而用丝/苏氨酸激酶抑制剂(TGF-β/Smad)处理后，RhoA、Rock1、Smad2 mRNA 表达下降，说明TGF-β1可介导Rock信号转导通路的活化，表明两条信号通路之间存在交叉作用。在博来霉素致PF模型中，Y-27632(Rock特异性抑制剂)作用于Rho/Rock 信号通路，抑制肺成纤维细胞迁移，减少肺组织ECM沉积，从而改善博来霉素导致的肺成纤维细胞增生和胶原蛋白沉积[22]。

2.3 TGF-β/Smads通路抑制剂

2.3.1 药物治疗 TGF-β通路在PF产生发展中起重要作用。吡非尼酮是一种人工合成的吡啶酮化合物。体内外实验研究[23]表明，吡非尼酮通过抑制TGF-β活化而发挥抗炎、抗纤维化作用，是目前被批准用于临床治疗特发性PF(idiopathicpulmonary fibrosis，IPF)的药物。吡非尼酮抗纤维化具有广谱性，尤其对PF、肾小球纤维化具有明显治疗效果，因其具有良好的安全性和耐受性，是改善IPF患者临床症状的靶向药物之一[24]。Chen等[25]实验结果表明，实验组加入吡非尼酮后可有效减少TGF-β1 诱导的细胞内 FN1、HSP47 mRNA 和HSP47蛋白表达量，减少了细胞外基质过度沉积。同时证明，吡非尼酮可以抑制TGF-β1诱导的肺上皮细胞向间质细胞转化。尼达尼布是另一种TGF-β抑制剂，通过与生长因子受体三磷酸腺苷竞争性结合，抑制肺间质成纤维细胞增殖、分化、迁移。Wollin等[26]研究表明，尼达尼布抑制肺成纤维细胞增殖，减少α-SMA 表达量，缓解炎症纤维化程度，改善患者预后。Wuyts等[27]研究发现，阿奇霉素不仅能够明显减少肺组织胶原蛋白、羟脯氨酸含量 ，而且可增加大鼠肺活量，改善大鼠肺通气，其机制可能与下调β-catenin 表达有关。Xiang 等[28]研究发现， 使用新对叶百部碱干预博来霉素(bleomycin， BLM)，诱导VC，可降低胶原Ⅰ、α-SMA和 TGF-β1水平，且TGF-β1水平与新对叶百部碱浓度呈剂量依赖关系。维生素D治疗可减少肺组织中羟脯氨酸含量，减少促纤维因子TGF-β表达，抑制肺间质成纤维细胞活化，阻断EMT发生，有效缓解BLM诱导的PF[29]。秦静等[30]研究显示，早期应用丹参素可以增加肺组织超氧化物歧化酶活性，减少丙二酸、羟脯氨酸含量，减轻博来霉素诱导的大鼠PF程度。其可能机制为下调TGF-β1、Smad3 mRNA和促进Smad7 mRNA的表达。

2.3.2 基因及细胞因子治疗 miR-326首次发现其高表达在神经元，具有抗神经衰老作用。在NIH/3T3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)研究[31]中发现， miR-326通过影响TGF-β1表达，上调MMP-2、MMP-9等抑纤维化基因表达。说明miR-326可以抑制TGF-β1活性，控制细胞形态改变，作为一种新型的抗纤维制剂。miR-21是最早发现的一种致癌性miRNA，可以影响包括PTEN基因在内的多种肿瘤抑制基因活性。最近，在IPF小鼠的肺肌成纤维细胞中发现，miR-21表达是高度上调的。Yang等[32]在博来霉素诱导的小鼠PF中发现，应用miR-21抑制剂下调TGF-β1诱导的COL1、COL3和α-SMA的表达。用miR-21前体干预TGF-β1作用的MRC5细胞，发现诱导FN、α-SMA转录，尤其是诱导Smad2磷酸化和Smad7表达减少，说明miR-21在PF中也起到重要作用。基质金属蛋白酶(matrix metal-loproteinases，MMPs)/金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metallopmteinase，TIMPs)是降解ECM、抑制促炎因子表达和减轻PF程度的一类重要蛋白酶。其表达受多种细胞因子调控，如TGF-β下调MMP-1、 MMP-3和TIMP-2表达，促进MMP-2和 TIMP-1表达。研究[33]发现，MMP-2和TIMP-1主要降解Ⅳ型胶原、α-SMA、波形蛋白等细胞外基质，而肺基膜的损伤则可促进PF发展。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)是作为一种能刺激肝细胞增殖的物质而被提纯发现，是一种能刺激多种细胞生长、增殖以及分化的多功能细胞因子，HGF可以抑制TGF-β的表达，通过减少ECM产生和促进降解，进而减轻BIM诱导PF小鼠呼吸困难症状[34]。

3 小结

PF是各种慢性肺部疾病的终末期病理改变，目前仍无有效治疗药物。各种细菌、真菌、病毒感染、化学中毒、免疫损伤等物理、化学因素，使肺泡组织增殖、分化受到影响，肺泡上皮细胞发生形态改变，转化为肺成纤维细胞，成为ECM的重要来源。多种信号通路相互作用，共同参与EMT的发生、发展，明确EMT具体发生机制，研究针对不同信号通路的靶向药物，成为治疗PF药物遴选和研发的重要研究方向。目前，EMT机制研究还仅限动物实验研究，其具体机制未完全阐明，需要进一步研究，以研发更具有疗效的抗纤维药物。