牛支原体检测方法研究进展

王桂玲，吴胜昔，梁望旺，马培杰，曾 政，黄 恒，李 志

（1.重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054；2.重庆市动物疫病预防控制中心，重庆 401120）

牛支原体（mycoplasma bovis）易引起牛的局部炎症，如肺、乳房、生殖道、关节发炎甚至引起不孕等疾病［1］。1961年，牛支原体首次从患有乳房炎的奶牛所产的牛奶中分离出来。1976年，研究确定了牛支原体可导致各类呼吸系统疾病［2］。随即，牛支原体相关疾病快速蔓延到多个国家及地区的牛群，严重制约了畜牧业和经济的快速增长。据报道，欧洲每年25.1%～33.8%的犊牛感染牛支原体肺炎，损失高达1.43亿～1.93亿欧元。英国每年有190万头左右的牛感染牛支原体肺炎。在美国，因牛支原体引起的疾病如牛呼吸系统疾病、肺炎等产生的损失高达1.40亿美元。据报道，美国牛场的感染率达到了71%［3］。继2008年之后，我国的多个地区相继爆发了由牛支原体引起的传染病，主要症状有发热、咳嗽、流鼻涕等。鉴于一般药物的治疗效果不理想，再加上没有相应的疫苗，因而给我国养牛业造成了巨大的经济损失。

支原体具有高度的传染性，急需一种快速、有效的诊断方法来预防和控制该病的爆发。目前对牛支原体检测技术的研究主要有3个方面：病原体抗原诊断、血清学抗体诊断、基因诊断［2，4］。血清学检测法更适用于慢性感染病以及注射过抗生素的病例，这是因为牛支原体能刺激牛脂质和蛋白抗原引起免疫反应，产生的抗体可在血清中存活数月。在基因诊断方法中，PCR技术是鉴别牛支原体及牛无乳支原体的一种重要技术。随着分子以及各种免疫学技术的不断进步，越来越多地应用于牛支原体病检测的新型技术被相继报道。本文对牛支原体传统以及新型实验室诊断技术的研究进展作简要综述［5-28］。

1 病原体抗原诊断

1.1 病原体分离培养检测法

在无菌的条件下将牛支原体组织样本接种在固体培养基表面，5%CO2的环境下培育3～4 d，支原体的菌落呈现出“煎蛋样”的典型菌落形状，菌落的外部整齐光滑且呈外薄内厚，接种在含有酚红的液体培养基中，培养基颜色会发生以下变化：红色变为黄色，液体透彻且明亮［5］。鉴于牛支原体的分离鉴定具有难度大、稳定性低、灵敏性低以及培养周期长等缺点，故而不能将其作为一种早期检测技术。虽然病原分离培养法具有直接简明的优点，但此法会消耗大量的人力物力，实验操作步骤繁琐，而且试验周期较长，以致贻误最佳的治疗时间，因而不能作为一种常规的检测方法推广。

目前对于分离培养检测方法有了进一步的研究。牛支原体的分离受外界环境的影响。Thomas等［13］同时对牛支气管肺泡灌洗液和鼻腔的病原体进行分离，通过对比发现，前者的分离率高于后者。得到的新鲜的组织样品应该尽量在1 d内通过无菌分离再进行培养。通过使用不同的拭子样品发现：使用尼龙以及聚酯纤维等的分离率明显比传统的棉签拭子（P＜0.05）要高，分析原因可能是尼龙和聚酯纤维对病原体产生的毒害作用较棉签更小，还有可能是前者能够增加病原体样本的采集和扩大样本的释放量［6，10］。经证实，通过滤膜处理后的病原体样本再进行接种可以大大提高牛支原体的分离率［7］。分离培养结束之后，结合特定的染色技术以及相应的生理生化反应即可初步鉴定牛支原体。

1.2 免疫酶技术

间接免疫过氧化物酶法以及酶联免疫过氧化物（ELIP）能够用来诊断病牛肺中的牛支原体，此法能有效地克服荧光抗体检测技术存在的诸多缺陷：对于慢性感染的病牛不敏感、对样本的新鲜度要求较高、需使用荧光显微镜观察、牛支原体样本保存周期短等［7］。通过免疫酶技术对肺切片进行检测后再涂片，即可明显观察到被染成淡红色的各种大小不同的支原体颗粒，这种检测方法目前只针对于猪、羊等肺部的支原体，但在牛支原体的诊断中还比较罕见。

1.3 免疫组化技术

免疫组化法是一种高特异性、高灵敏性的检测技术。免疫组化可实现对牛支原体的定位检测，从而可以得到机体内牛支原体的大致分布状态［8，11］。例如，免疫组化技术检测到，在干酪状坏死性支气管肺炎中的支原体抗原大多存在于坏死灶的四周；抗原集中分布在巨噬细胞、肺泡以及支气管管腔的大多数淋巴细胞和白细胞中。当机体内的牛支原体经分离培养检测为阴性时，可通过免疫组化技术对其进行定位和鉴定［9，13，17］。免疫组化技术具有高特异性和高灵敏性的优点，但唯一不足的是此法只能检测较小的病灶区域组织，而对于较大的病灶区域或者是病变的程度较轻时，此法就显得束手无策。

2 血清学抗体诊断

血清学检测法是通过测定体内的特定抗体量来诊断出动物体内的抗体水平，而且还能够对牛支原体病原的慢性携带者进行诊断［12］。免疫学检测技术是目前最热门诊断方法之一，主要有补体结合试验、间接血凝试验、琼脂扩散试验、花环试验、生长抑制试验及间接酶联免疫吸附试验等［14，16］。该方法的检测机理是：牛支原体的病原体能够特异性地结合相应抗体，从而刺激机体产生特异性免疫反应，进而能够在机体早期感染了牛支原体后及时地做出一种高效以及特异性的诊断。

目前常用的鉴定诊断技术主要有：生长抑制试验法（GI）、代谢抑制试验（MI）、生物膜形成抑制试验（FI），其中酶联免疫实验（ELISA）是一种最广泛的方法［15］。较其他方法而言，ELISA法具有高敏感性和高特异性，能在短时间内实现高效准确的自动检测。通过此法得到的各项检测结果能实现对牛支原体感染的血清学流行疾病和暴发性流行病的测定，还能借此判析牛群的感染状态。在欧洲和部分北美国家及地区早就广泛使用ELISA法来检测牛奶中的抗M.bovis含量，这也给了我们一种启示：ELISA检测法可能也可用于检测牛支原体感染的病变部位［19］。国外的研究者花了大量时间研究ELISA检测法。初期的ELISA诊断是把全菌灭活之后再进行包被，但是出现了非特异性的抗原交叉反应，对诊断结果产生较大的影响，因而在当时并没有引起大众的关注［18］。先后有 Howard、Boothby、Byrne以及 Blackburn等利用ELISA法对组织样品培养物、血清样品、奶样等样本直接进行检测，从而统计牛支原体的感染率以及发病状况，其有效性和准确性较传统的鉴定方法确有提高［21-22］。

近来有报道称，牛支原体膜表面可变蛋白Vsp（Variable surface lipoproteins）家族可用于诊断自然感染和人工感染。鉴于此蛋白的表面抗原表位会随时间发生改变，因此人们尝试将该蛋白插入到特定基因，结果显示产生了稳定表达［23］。由于牛无乳支原体和牛支原体的16SRNA具有极高的同源性，故在外界环境条件变化而引发的病理和所表现出来的临床症状都很相像，因此科研学者们通过将膜表面可变蛋白Vsp上的48基因作为目的基因插入到特异基因中并进行表达，就能用于诊断牛支原体。实验结果证实了这种方法的可行性［27］。

Ball等［22］首创了一种夹心 ELISA法诊断技术，此项技术目前已经成为了一种商业化诊断产品。首先是建立一个牛特异性支原体单克隆抗体，再与待测定培养基中的牛支原体抗原发生特异性免疫反应从而判定是否含有牛支原体抗原。Ghadersohi等［28］利用单克隆抗体技术制备了一种阻断性抗体，构建了一种间接阻断法，用来诊断牛支原体抗体。通过对比间接阻断法和PCR诊断法可以发现：前者在反应的特异性和灵敏性上都占有优势，而且没有交叉反应的影响，因而是一种极具前景性的诊断方法。

目前，血清学诊断方法是用于检测牛群感染牛支原体的一种常用技术，在具有优势性的同时，难免有一些缺陷，比如在牛群中存在较高的牛支原体的阳性血清率会影响检测结果，血清中产生的牛支原体抗体滴度的高低和能否患上牛支原体疾病之间不存在直接关联等，这些缺陷都限制了血清学诊断法的使用范围，因而使血清学诊断法不能成为一种常规的诊断方法而得到进一步的发展和应用［25］。

3 免疫印迹法

免疫印迹法（Immunoblotitng）是将免疫覆盖液作为探针，对抗体或抗原进行印迹分析的统称［11，26］。通过血清学诊断技术与蛋白印迹相结合的方法，可使试验结果更加具体可靠。Sachse等利用免疫印迹法对牛支原体的单抗MAb1E5、4F6以及MAb解析后发现，8种Vsp蛋白与宿主产生粘附现象的原理。Thomas［13］通过多次试验论证后发现：几乎每一株分离后的Vsp蛋白菌株都表现出了较高的特异性。Ghadersohi等［26］通过对硝酸纤维素膜上的精氨酸支原体、无乳支原体，牛生殖道支原体和牛支原体的完整细胞膜蛋白进行免疫印迹分析，发现实验结果只出现了牛支原体的49 kDa以及80 kDa两个片段，同时也证明了牛支原体含有唯一的单克隆E4蛋白。

4 基因诊断

4.1 常规的PCR检测技术

在核酸水平检测牛支原体的技术中，最普遍的是PCR法。但由于牛无乳支原体和牛支原体的16SRNA具有极高的同源性，故利用PCR扩增16 S rRNA难以鉴别牛支原体和牛无乳支原体。针对uvrC基因设计的引物，经扩增后可直接作用于鼻拭子样本，还能直接检测含有防腐剂的牛奶，随着扩增过程中颜色发生的变化能及早地诊断出牛支原体，此法快速高效且准确率较高，同时还能特异性地区分牛无乳支原体和牛支原体［24］。

Cai等［15］创建了一种扩增16srRNA的实时PCR法。构建原理是基于杂交探针和退火温度相结合应用的一种检测方法，此法能够实现对牛乳支原体的快速有效的检测与鉴定，同时还具有高特异性和敏感性。此外，以DNA聚合酶Ⅲ和ATP结合蛋白oppD／F基因共同结合到特定基因，并作为目标基因的PCR法已经被公认为是一种能够有效区分感染牛无乳支原体或牛支原体的方式。Foddai［19，21］利用牛支原体的 p81基因设计出一种多重的PCR检测技术，最后通过PCR-RFLP法对牛支原体p81基因序测序和分析，此法能极大地提高支原体检测的特异性。2008年，我国正式开始研究此类病原体，截至目前，已经取得了很大的进步。比如李媛等［11］利用牛支原体的oppD基因、F基因的2对特异性的引物，设计了一种高灵敏、高特异性的套式牛支原体PCR检测法。还有一种针对牛特异性基因uvrC构建的环介导等温扩增（LAMP）高效诊断技术，该方法灵敏性较高，可达34 cfu·mL-1。李大伟等［17］创建的一种三重PCR检测法，实现一次性测定牛支原体、无乳支原体、丝状支原体丝状亚种小克隆，具有高特异性和高灵敏性。

截至目前，我们对核酸放大技术（NAATs）有了更深一步的认识，通过大量试验研究发现：病原体的存活状态、免疫反应中抗体生成的时间以及数量等因素都不会对NAATs的实验结果产生影响［18，26］，这无疑进一步提高了牛支原体检测技术的高效性。此项检测方法在抗生素的规范使用、降低牛支原体病的发病率和病死率，以及传染性疾病领域的研究都具有深刻的意义。

4.2 实时PCR检测法

据相关实验报道，花菁SYBR绿色染料与所有双链DNA结合后，在520 nm处产生光发射，随着双链DNA数量的增加，染料发光量相应增加，从而可以实时检测PCR产物［13］。与基于探针的实时PCR方法相比，SYBR Green提供了一种成本更低的实时PCR分析方法，因为SYBR Green不需要合成特定的寡核苷酸序列，因此可以产生更高的背景信号和较低的特异性。虽然此法不适于猫科动物中支原体的检测，但可用于检测散装罐内牛奶样品中的多株支原体［13，21］。此项技术已被证实可以对含有多个物种的几个样本进行生物鉴定。SYBR绿色技术还被用于开发一种特异性PCR检测牛结膜拭子中的牛分枝杆菌，作为传染性牛角结膜炎流行点研究的一部分。

为了获得更高的特异性，建立了实时PCR荧光报告探针方法，该方法主要将引物杂交，再与引物结合位点内的靶区相结合［3，15］。由于水解探针与目标序列特异性结合，大大降低了背景信号，提高了特异性分析。不同的探针也可以与不同的报告基团和猝灭基团结合，在一个单一反应中重复检测，节省时间和试剂。据报道，几种新型的牛分枝杆菌实时PCR检测技术已经研制成功。尽管基于探针的PCR技术可获得更高的特异性，但与牛分枝杆菌16 SrRNA基因相结合时仍会产生交叉扩增的现象。因此通过对替代基因的筛查发现uvrC基因是牛分枝杆菌较好的PCR目标，它与包括牛分枝杆菌在内的非牛分枝杆菌没有交叉扩增。uvrC基因编码脱氧核苷化酶，是一种复制所必需的酶，因为它与DNA修复有关，因此是一个高度稳定的基因［18，26］。在牛 M.bovis和 M.Agalactiae中，它是一个非常保守但有显著差异的基因，这使得它成为比16S rRNA更特异的靶基因，同时在肺、牛奶、关节液、鼻拭子的临床标本上证实了uvrC基因作为鉴定牛分枝杆菌的靶标的可行性。

5 结束语

支原体在牛群中引起的各类传染病和严重的相关疾病已对我国的经济和农牧业造成严重的负面影响。快速诊断有助于疾病的控制和预防。分离培养法提供了一个明确的分离物用于DNA的提取和预防，以调查感染来源和菌株与其他菌株的相关性。聚合酶链式反应试验提供了一种快速诊断法。快速诊断有助于及时对病态牛作出处理，从而减少疾病传播风险。血清学诊断提供了一种可供选择的评估法：不同畜群或畜群内的特定动物群体的接触情况。综上，所采用的诊断方法需要考虑遗传限制、诊断的迫切性，测试可用性、样本类型和处理条件。每一种检测方法都有其优势以及局限性，综合使用每一种检测方法将会对各自的优势和不足相互补充。