不同地区浓香型大曲质量指标与细菌群落相关性研究

吴

（1.四川理工学院酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川自贡643000；2.成都海关驻宜宾办事处，四川宜宾644000）

“曲乃酒之骨”，大曲是白酒酿造中物系、微生物及酶系的载体，在白酒发酵过程中具有至关重要的糖化发酵生香的作用，其质量与白酒品质息息相关[1]。由于大曲制作过程中受原料、环境的影响较大，使得大曲中微生物情况十分复杂，其中含有大量不同种类的真菌和细菌，尤其是细菌类群极为丰富。

王晓丹等[2]对浓香型大曲中的酶系性能指标和白酒中的微量成分进行了检测，探讨了大曲酶系与白酒品质的关系，总结出大曲糖化力高，而蛋白水解酶、酯化酶活力低，长期使用，白酒质量和产量必然出现下降的趋势。高亦豹等[3]运用PCR-DGGE技术对高温和中温大曲进行细菌的群落结构分析，结果表明Weissella cibaria、L.helveticus、L.fermentum、L.panis 等 乳 酸菌在大曲中普遍存在，而Thermoactinomyces sanguinis仅存在于高温曲中。梁晨等[4]通过高通量测序技术对大曲贮存过程中原核微生物群落结构及风味成分的变化规律进行了研究，结果发现乳杆菌属、芽孢杆菌属、高温放线菌属等是大曲中的优势菌群，且大曲贮存有利于酸、醇、酯的积累且能降低异味物质含量。目前白酒行业还没有制定出相对统一的大曲质量标准，因为不同地区、不同酒企所产大曲的各项指标及其中微生物种类均存在较大差异，因此为了深入了解不同产地浓香型大曲的差异，本试验对四川3个地区的4个不同浓香型酒企所产大曲进行质量指标的测定，并通过高通量测序技术分析其细菌群落结构，并结合质量指标和细菌群落结构进行相关性分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大曲样品分别取自宜宾（最高品温60℃）、泸州（最高品温58℃）和遂宁（最高品温均为55℃），每组样品随机取3个平行样本，一部分置于-20℃冷藏用于大曲基因组的提取，另一部分4℃保存用于大曲质量指标的测定。

氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠、可溶性淀粉、L-酪氨酸、干酪素、己酸、无水乙醇、葡萄糖（均为分析纯）：成都市科龙化工试剂厂；硫酸、盐酸（均为分析纯）：重庆川东化工有限公司；福林试剂：国药集团化学试剂有限公司；饱和酚、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）（均 为 分 析纯）：北京索莱宝科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷（Trisbase）（分析纯）：美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

Lynx6000型高效落地高速离心机、TSE240VULTS超低温冰箱：美国Thermo公司；ChemiDoc XRS+型水平电泳仪：美国Bio-rad公司；UV-2000型紫外可见分光光度计：上海尤尼柯有限公司；DZKW-4型恒温水浴锅：北京中兴伟业仪器有限公司；BS-2F数控恒温摇床培养箱：常州精成国华仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 大曲质量指标的测定方法

大曲水分、酸度、淀粉含量、糖化酶活力、酯化力、液化酶活力、发酵力、酸性蛋白酶活力均参考文献[5]中的方法步骤。其中糖化酶活力的定义为1 g绝干曲40℃，pH4.6的环境下反应1 h后，将淀粉水解生成葡萄糖的毫克数，1 mg即1个酶活单位（U/g）。液化酶活力是指1 g绝干曲在60℃、pH 6的环境下反应1 h后，液化可溶性淀粉的克数，1 g即1个酶活单位（U/g）。蛋白酶活力定义为1 g绝干曲在40℃、pH值为3.0条件下1 min水解干酪素产生1 μg酪氨酸所需的蛋白酶量为1个酶活力单位（U/g）。

1.3.2 大曲基因组的提取

将同一大曲的3个平行样本等量混合后进行DNA的提取，本试验采用改良的CTAB[6]法提取大曲中微生物的基因组。

1.4 数据处理

大曲质量指标的试验结果用平均值±标准差表示，使用SPSS 19.0软件中的一般线性模型单因素Duncan法对数据进行方差分析和相关性分析。将高通量测序所得序列与Silva数据库进行比对，获得操作分类单位（operational taxonomic units，OTU）分类。再利用SPSS 19.0软件对大曲质量指标和微生物群落结构进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同产地大曲的理化特征

水分、淀粉含量、酸度是衡量大曲质量的重要指标。通常质量等级为一级的大曲水分含量要求低于13%，淀粉含量低于58%，酸度控制在0.9 mmol/10 g～1.3 mmol/10 g之间[1]。本试验通过比较4种不同地区大曲的理化特征，分析其差异，结果见图1。

大曲水分含量的高低主要由制曲温度、发酵情况和储存时间等因素决定，较低的水分含量有利于降低微生物的生长代谢使得大曲易于保存。由图1可知4种浓香型大曲的水分含量均在10%～14%之间，从高到低依次是遂宁1、泸州、遂宁2、宜宾曲样，且水分差异均达到显著水平（P＜0.05），其中仅遂宁1大曲水分含量超过13%，表明各大曲均得到了良好的储存，这将有利于大曲中复杂的菌系得以保存。

图1 不同产地大曲理化差异Fig.1 Physical and chemical indicators diversity of different regions’Daqu sample

大曲中淀粉是作为微生物生长代谢的主要能量来源，其含量可以客观反映在制曲过程中大曲的发酵情况。根据图1的结果，4种大曲的淀粉含量在51%～59%之间，其淀粉含量高低依次是泸州＞遂宁2＞遂宁1＞宜宾曲样，且差异均达到显著水平（P＜0.05），尤其是宜宾大曲的淀粉含量低于了52%。这说明大曲中微生物代谢较旺盛，大曲发酵良好，有助于大曲中淀粉酶、糖化酶等酶的积累，同时随着大曲载体进入白酒酿造过程。

酸度的大小主要是由产酸微生物进行有机酸代谢以及脂肪、淀粉和蛋白质的降解[7]形成的，大曲酸度的大小在一定程度上揭示了产酸微生物的活跃性，也能在一定程度上反应出脂肪酶和蛋白酶活力的大小。4种曲样的酸度相差不大，均维持在0.9 mmol/10 g～1.06 mmol/10 g，符合一级大曲的酸度范围，其中遂宁2曲样的酸度最高，且显著高于其他3种曲样（P＜0.05），可能含有更丰富的产酸菌。

2.2 不同产地大曲的酶活

大曲中的微生物在经过长时间的生长代谢后能不断积累丰富的酶系，这些酶系对酿酒原料的利用及白酒的呈香呈味起着重要的作用。通过对大曲酶活的检测，能较好的反应不同大曲之间的质量差异，检测结果及酪氨酸标准曲线见图2。

如图2所示，4种曲样的糖化酶活力在630 U/g～730 U/g之间，均具有较高水平，其中遂宁2和泸州曲样的糖化酶活力差异不显著（P＞0.05），宜宾曲样的糖化酶活力最高达到729.3 U/g，显著高于其他3种曲样；液化酶活力方面，4种曲样均存在显著的差异（P＜0.05），宜宾曲样的液化酶活力最高，达1.75 U/g，而泸州曲样的液化酶活力最低，为1.00 U/g。遂宁两个曲样的液化酶活力在宜宾和泸州曲样之间。大曲中的液化酶和糖化酶主要是由霉菌产生，因此糖化酶和液化酶的酶活力的高低可侧面反映出样品中霉菌生长繁殖的差异。大曲的糖化酶和液化酶能促进原料中的淀粉转化为可发酵性糖，可大大提高原料利用率和出酒率，因此高活力的糖化酶和液化酶有利于产酒。结合图1各大曲淀粉含量的差异可得，淀粉含量相对低的大曲，其糖化力和液化力均较高。

由酪氨酸标准曲线计算可得，吸光常数K=95.14，在95～100范围内，因此可作为常数用于计算酪氨酸含量。如图2可得，遂宁1和泸州曲样酸性蛋白酶活力差异不显著（P＞0.05），其余曲样均差异显著（P＜0.05），其中遂宁2曲样的酶活最高，达到49.1 U/g，宜宾曲样的酶活最低为28.8 U/g。白酒发酵是在酸性环境下进行的，大曲中的酸性蛋白酶能在该条件下将原料中的蛋白质水解成氨基酸，有助于美拉德反应的产生及其他风味物质的生成，因此酸性蛋白酶活力的高低对白酒风味的形成具有直接的影响。

图2 不同产地大曲主要酶活差异Fig.2 The main enzyme activity diversity of different regions’Daqu sample

2.3 不同产地大曲的生化指标

发酵力和酯化力是反映大曲产酒和生香能力的重要指标，大曲酯化力越高则在白酒酿造过程中能产生更多的酯类化合物，发酵力反映了大曲中微生物的生长繁殖和发酵速度，可以在一定程度上考察大曲的发酵性能。4种曲样的酯化力和发酵力测定结果如图3所示。

遂宁1和遂宁2曲样的酯化力分别为11.2 mg/（g·100 h）和13.6 mg/（g·100 h），无显著差异（P＞0.05），宜宾和泸州曲样的酯化力较遂宁两个曲样高，分别达到24.5 mg/（g·100 h）和31.4 mg/（g·100 h）且差异显著（P＜0.05）。发酵力方面，宜宾、遂宁2和泸州曲样的发酵力并无显著差异（P＞0.05），均在0.24 g/（g·72 h）左右，而遂宁1曲样的发酵力达0.57 g/（g·72 h）显著高于其他曲样，表明其在接入到发酵液后微生物的繁殖旺盛，呼吸作用较强，产气较多。

图3 不同产地大曲生化指标差异Fig.3 The biochemical indicators diversity of different regions’Daqu sample

2.4 细菌群落结构分析

2.4.1 各大曲样品中细菌OTU分类

大曲样品细菌Alpha多样性指数见表1。

表1 大曲样品细菌Alpha多样性指数Table 1 Alpha diversity index of Daqu sample’s bacteria

OTU是在系统发生学或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，通过归类操作，将序列相似性大于等于97%分归为同一OTU。由表1可知，遂宁1和遂宁2曲样OTU数最高，分别为163个和162个，其次是宜宾曲样（96个），最低的是泸州取样（79个）；此外4个曲样的优质序列分别为18 157条、29 172条、33 850条和25 974条。结合各大曲样品的OTU数量和Ace、Chao等多样性指数可判断，遂宁1和遂宁2曲样中的细菌群落多样性高于宜宾和泸州曲样。由于制曲工艺的差别，遂宁两个曲样的最高品温均为55℃，而宜宾和泸州曲样的最高品温分别达到60℃和58℃，因此遂宁曲样细菌多样性更丰富的原因可能是由于其生产品温相对较低，进而有利于各类微生物的生长和保存。

2.4.2 大曲样品中细菌属的分类

大曲样品中细菌属类分布情况见表2。

表2 大曲样品中细菌属类分布情况Table 2 The distribution of bacterial genus Daqu samples

由表2所示，除去丰度低于1%的菌属（others），4种曲样中一共得到20个优势细菌属类，其中，宜宾曲样的优势菌属为魏斯氏菌属（Weissella，25.23%）、芽孢杆菌属（Bacillus，19.96%）、高温放线菌属（Thermoactinomyces，16.26%） 和 糖 多 孢 菌 属（Saccharopolyspora，14.79%）；遂宁 1曲样中葡萄球菌属（Staphylococcus，26.38%）、Kroppenstedtia属（12.77%）和芽孢杆菌属（Bacillus，9.73%）所占比例较高；遂宁2曲样占主导地位的菌属为葡萄球菌属（Staphylococcus，31.62%）、糖多孢菌属（Saccharopolyspora，15.87%）、Kroppenstedtia属（11.64%）和芽孢杆菌属（Bacillus，9.48%）；此外，乳杆菌属（Lactobacillus，28.96%）、魏斯氏菌属（Weissella，27.66%）、高温放线菌属（Thermoactinomyces，13.12%）、片球菌属（Pediococcus，7.39%）在泸州曲样中为优势菌属。整体来看，宜宾和泸州曲样的占主导地位的细菌类群更为相似，魏斯氏菌属、高温放线菌属等均占较高比例，与王彩虹[8]得到的浓香型大曲优势菌属较为一致；但与之不同的是遂宁两个曲样中葡萄球菌属、Kroppenstedtia属、芽孢杆菌属、糖多孢菌属（Saccharopolyspor）均占其主导地位，各大曲之间细菌类群和而不同，可能正是由于这种微生物的差异性，导致不同产地的浓香型白酒各具特色。因为不同的微生物类群对白酒酿造具有不同的功能和影响，其代谢产物对白酒的风味具有直接的影响，微生物酿造性能的不同是导致同一香型白酒各具特色的主要原因之一。如：魏斯氏菌属（Weissella）属于乳酸细菌，具有代谢乳酸的能力[9]，进而生成乳酸乙酯，是白酒酿造中的主要微生物之一[10]。葡萄球菌属（Staphylococcus）广泛分布于土壤、空气、水、灰尘中[11]，在酿造工业有多次报道[12-13]，但未见其在白酒生产中具有的功能研究。芽孢杆菌属（Bacillus）因能形成芽孢而对环境具有极强耐受性，是白酒酿造中产酶生香的重要微生物之一[14]。糖多孢菌属（Saccharopolyspora）属于放线菌纲下的一类微生物[15]，能产生酶类、维生素、纤维素降解促进因子等，是一类安全的生物资源菌，在浓香型大曲中普遍存在。高温放线菌属（Thermoactinomyces）具有耐高温、生长快的特点，通常中高温大曲的生产品温会超过55℃，因此高温放线菌由于其耐高温及其产蛋白酶和纤维素酶[16]的特性对大曲生产乃至白酒酿造过程中均具有重要作用。因此，大曲的生产过程，实际也是富集菌群，积累酶系的过程。

2.5 大曲微生物群落与质量指标的相关性分析

利用SPSS数据分析软件，选择在属分类下样品中丰度大于1%的菌属与液化酶、糖化酶、酯化力、发酵力、蛋白酶、酸度进行Pearson相关性分析，研究大曲微生物群落结构与各质量指标的相互关系，细菌群落结果如表3所示。

表3 大曲细菌群落与质量指标相关性分析Table 3 Daqu bacteria and quality indexs correlation analysis

由表3可知，在所考察的细菌属中没有与酸度、糖化酶和液化酶呈显著相关的菌属；与酯化力有显著相关性（P＜0.05）的菌属有魏斯氏菌属（Weissella）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、片球菌属（Pediococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus），其中魏斯氏菌属（Weissella）与大曲酯化力呈显著正相关（P＜0.05），片球菌属（Pediococcus）呈极显著正相关（P＜0.01），葡萄球菌属（Staphylococcus）与酯化力呈负极显著相关（P＜0.01），乳球菌属（Lactococcus）呈极显著负相关（P＜0.01），说明大曲的酯化力高低是由复杂的微生物群落间共同作用的结果；与发酵力有显著相关（P＜0.05）的菌属为链霉菌属（Streptomyces）和短状杆菌属（Brachybacterium），链霉菌属（Streptomyces）呈正相关，短状杆菌属（Brachybacterium）呈极显著正相关（P＜0.01）；不动杆菌属（Acinetobacter）与酸性蛋白酶活力呈极显著正相关。因此，在进一步的研究中，将重点关注那些与质量指标相关性显著的菌群，以进一步探讨微生物对大曲质量的影响。

3 结论

对4个不同酒厂曲样的水分、淀粉、酸度、糖化酶活力、发酵力等质量指标进行测定和分析，结果表明宜宾曲样的水分、淀粉含量和酸性蛋白酶活力显著低于其它曲样（P＜0.05），而糖化酶活力和液化酶活力显著高于遂宁和泸州曲样（P＜0.05）；遂宁1曲样的水分和发酵力显著高于其它曲样（P＜0.05），其糖化酶、液化酶和酸性蛋白酶活力均处于中上水平；遂宁2曲样的酸度和酸性蛋白酶活力显著高于其它曲样（P＜0.05），而其他指标在4个曲样中处于中下水平；泸州曲样的淀粉含量和酯化力最高，且显著高于遂宁和宜宾曲样（P＜0.05），但液化酶和糖化酶活力较低，且液化酶活力显著低于其他曲样。综合来看，不同产地的大曲样品质量指标存在差异，但又各有所长。通过对细菌群落结构进行分析可得，遂宁两个曲样的细菌群落多样性均高于宜宾、泸州曲样。微生物群落方面，宜宾和泸州曲样的占主导地位的细菌类群更为相似，魏斯氏菌属、高温放线菌属等均占较高比例；而遂宁两个曲样中葡萄球菌属、Kroppenstedtia属、芽孢杆菌属、糖多孢菌属（Saccharopolyspor）均占其主导地位。结合大曲细菌群落结构与各质量指标进行相关性分析发现，魏斯氏菌属（Weissella）、葡萄球菌属（Staphylococcus）与大曲酯化力的相关性达到显著水平（P＜0.05），片球菌属（Pediococcus）、乳球菌属（Lactococcus）与大曲酯化力的相关性达到极显著水平（P＜0.01），因此可推断大曲的酯化力高低是由复杂的微生物群落间共同作用的结果；链霉菌属（Streptomyces）和短状杆菌属（Brachybacterium）与发酵力呈显著相关（P＜0.05）；而酸性蛋白酶活力仅与不动杆菌属（Acinetobacter）呈极显著正相关。通过本研究能充分了解不同地区浓香型大曲的质量指标及细菌群落的差异，进而加深对不同产地浓香型白酒特色风格的认识，从而推进四川浓香型白酒行业的发展。