功能性纳米材料免疫层析技术在兽药残留检测中的应用

胡高爽，高山

（河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050018）

随着经济的发展和人民生活水平的提高，动物源性食品安全逐渐成为当今世界人们所关注的焦点问题，兽药残留作为影响动物性食品安全的最主要因素之一[1]，近年来受到了广泛关注。由于兽药残留在食品基质中的痕量性存在和复杂多样性，针对其开发简单快速、灵敏可靠的检测方法，具有重要的研究价值和现实意义，是实行食品安全有效监管、保证食品安全的重要途径。

目前，针对兽药残留检测的方法有微生物法[2-3]、薄层色谱法[4]、毛细管电泳[5]、气相色谱[6]、液相色谱[7]、色谱—质谱联用技术[8]等，尽管上述的这些方法，可以被应用于兽药残留的有效检测，但是他们存在一定的局限性。如仪器分析法，样品预处理步骤繁琐，需要萃取、分离、净化、衍生化等，检测时间长，且需要专业人员的操作和维护，不适合用于现场快速检测，无法满足食品安全监管过程中的快速、高效的要求。

免疫分析技术（immunoassay，IA），是一种基于抗原（或抗体）作为选择性化学试剂特异性测定分析抗体（或抗原）的技术，具有专一性强、灵敏度高等优点[9-11]。其中免疫层析技术（如图1所示）是建立在免疫分析技术和色谱层析技术基础上的一项即时检测技术，具有操作简便、检测快速、价格低廉且环境友好等优点，广泛应用于食品安全检测领域。近年来，面对我国食品安全中兽药残留多样性和痕量性存在的特点，以及其在食品中持续动态变化的问题，出现了一些新型的基于功能性纳米粒子的免疫层析技术，他们突破了传统免疫层析技术在检测速度和灵敏度上的技术瓶颈，为兽药残留快速、高灵敏检测提供了新方法，也为食品危害因子的有效控制提供了新思路。

图1 免疫层析试纸条示意图Fig.1 Schematic illustration of the immunochromatographic strips

1 基于可视化纳米材料的免疫层析技术

1.1 胶体金免疫层析技术

胶体金免疫层析技术主要是采用胶体金对相关抗体进行标记，当金标抗体聚集到一定密度时（一般要达到107个/mm2），就会形成肉眼可见的紫红色，从而可对反应结果进行直观测定的一种技术。胶体金免疫层析技术是目前针对兽药残留检测中应用最为广泛的一种免疫层析技术。

王硕等[12-16]以硝基呋喃类兽药代谢物、四环素类兽药、庆大霉素、喹诺酮类兽药以及磺胺类兽药等为研究对象，建立了一系列针对其检测胶体金免疫层析试纸条，并应用于动物源性食品中兽药残留的可视化检测。Wu songsong等[17]建立了基于胶体金的竞争免疫层析方法，实现了鸡肉肌肉组织中金刚烷胺的快速灵敏检测，检测限能够达到1.80 ng/mL。Byzoua等[18]利用胶体金免疫层析技术，实现了牛奶中氯霉素的快速检测。然而，胶体金免疫层析技术使用胶体金作为抗体标记物，该方法的稳定性和灵敏度受到了一定的限制。

1.2 乳胶微球免疫层析技术

乳胶微球具有分散性好，粒径均一，色彩鲜艳等特性。Wang chen等[19]利用乳胶微球建立了针对牛奶中喹诺酮类、磺胺类和四环素类抗生素同时检测的免疫层析方法，并与传统的胶体金免疫层析技术进行了对比，所得的检出限显著小于欧盟所规定的最大残留限量（maximum residue limit，MRL），可以作为抗生素类兽药检测的方法。管笛等[20]建立了以彩色乳胶微球为标记物的免疫层析技术检测猪尿液中的盐酸克伦特罗，所建立方法的检出限为0.013 ng/mL，回收率范围为97.8%～106.0%之间。

1.3 其他新型可视化纳米材料的免疫层析技术

纳米碳是一种具有局部石墨化结构的无定形碳，外观为黑色粉末状固体，其基本粒子尺寸在10 nm～100 nm之间，具有稳定性好、易制备、无毒、不需要活化、灵敏度高及价格低廉等优点[21-22]。另外一种新型的纳米标记材料为纳米金-聚苯胺-纳米金微球（nanogold-polyanilinenanogold microspheres，GPGs），它是一种在实验过程中合成的纳米材料。其基本反应原理[23]为：在酸性介质中，采用氯金酸水溶液氧化苯胺，使苯胺单体发生氧化聚合，氯金酸被还原成胶体金，包埋在聚苯胺中，形成纳米金-聚苯胺复合物。再向聚合物中添加粒径为20 nm左右的胶体金溶液，通过物理吸附形成纳米金-聚苯胺-纳米金微球（GPGs），得到的纳米材料溶液稳定性良好，呈黑色。LIU等[24]利用胶体碳和纳米金-聚苯胺-纳米金微球构建了两种新型的纳米材料标记的免疫层析方法（如图2所示），并用于动物源性食品中沙丁胺醇类兽药残留的检测，由于其黑色信号与白色背景层析膜可形成强烈对比，因而具有较高的灵敏度，为新型纳米标记物在免疫层析技术中的应用提供了新思路。然而，其检测水平仍然只能达到定性或半定量级别，因此还需进一步开发可准确定量的其他配套检测手段。

图2 试纸条检测不同浓度沙丁胺醇的结果Fig.2 Typical strip tests of standard solutions with different SAL concentration after assay procedure

2 基于荧光纳米材料的免疫层析技术

2.1 荧光微球免疫层析技术

荧光微球是指将荧光染料通过物理吸附法、自组装法、化学键合法、共聚法、包埋法等吸附或包埋到粒子内而形成的直径在纳米至微米级（0.01 μm～1 μm），受激发光源激发能发出荧光的固体微粒。通过表面修饰技术使微球表面携带亲水性基团，使最终制备的荧光微球具有粒度均一、单分散性好、稳定性好、发光效率高、重复性好等特点，且具有较好的生物相容性[25-27]。因此，将其作为信号标记物应用于免疫层析技术，与胶体金免疫层析试纸条的原理相同，在质控线荧光强度一致的条件下，通过观察检测限荧光强度的消失，作为目标物的检出限。但由于其使用荧光材料作为标记物，能够显著增强方法的灵敏度。

朱海等[28]将荧光微球与呋喃唑酮代谢物单克隆抗体共价耦联在一起，以竞争法作为反应模式来制备出呋喃唑酮代谢物免疫层析试纸条，其灵敏度达1.0ng/mL，可满足相关检测标准要求，通过肉眼观察检测限和质控线之间的亮度，还可进行半定量检测。宋春美[29]选择具有优良发光性能的稀土配合物BHHCT-Eu3+为荧光材料，在反相微乳法合成SiO2的基础上，制备了共价型稀土荧光纳米颗粒，通过与盐酸克伦特罗单克隆抗体偶联，建立了基于荧光纳米颗粒标记的盐酸克伦特罗荧光免疫层析试纸。Bian等[30]利用荧光微球建立针对牛奶、血清和动物组织中头孢氨苄类抗生素检测的免疫层析方法，方法检测限＜0.1 μg/L。Chen 等[31]利用200 nm荧光微球建立了牛奶中磺胺甲嘧啶残留检测的免疫层析法，在样品中的检出限能够达到0.11 μg/L。Zhou等[32]同样采用荧光微球免疫层析法（如图3所示），建立了牛奶、蜂蜜、牛肉和猪尿中洁霉素快速检测的方法。

近来，荧光猝灭的现象引起了科研工作者的注意[33-35]，由于相互靠近的供体与受体通过偶极子-偶极子相互作用而产生的非辐射性的过程，进而发生能量共振转移出现荧光猝灭的现象，被广泛的应用于生物检测领域[36]，Shi等[35]利用荧光微球与胶体金之间发生荧光猝灭的现象，构建了新型免疫层析技术用于莱克多巴胺的检测，方法相较于传统免疫层析技术，检测模式由信号turn-off转变为turn-on型，使方法的灵敏度有了较大的提高，为针对兽药残留检测的免疫层析技术向着高灵敏的发展提供新方向。

图3 荧光微球免疫层析法测定洁霉素的结果Fig.3 Microsphere-based fluorescence immunochromatographic assay for monitoring lincomycin

2.2 量子点免疫层析技术

量子点（Quantum dots，QDs），是一种由 II-VI或者III-V族元素组成的准零维纳米材料，通常它们的直径为1 nm～10 nm之间[37-38]。由于量子限域效应，QDs具有很多特殊的光物理性质。（1）光稳定性好，可被重复激发，能保持数小时较强的荧光强度且不易漂白；（2）具有较宽的激发光谱。有一个比较广泛的激发波长范围；（3）尺寸依赖性的光学性能，同一激发不同发射，有利于同步检测的应用[39]；（4）发射光谱窄，减少不同粒径QDs发射光谱的重叠，有助于多标记检测[40-41]。因此，QDs可以作为一种优越的荧光材料用于生物标记分析。

Berlina等[42]建立了基于量子点的新型荧光免疫层析方法用于牛奶中氯霉素的检测，该方法针对氯霉素的检出限能够达到0.2 ng/mL，检测时间不超过20 min。Taranova等[43]利用量子点尺寸效应，建立了基于不同发射波长量子点的牛奶中多种抗生素类兽药残留同时检测的“交通灯”荧光免疫层析技术。

此外，在先前研究的基础上[34，44-47]，根据荧光能量共振转移的原理，利用发射波长为532 nm的量子点作为能量供体，吸收波长为520 nm的胶体金作为能量受测提供了新思路[49]。

图4 磺胺类和喹诺酮类兽药多残留量子点荧光猝灭免疫层析检测方法示意图Fig.4 Schematic of QDs-based FQICS for the detection of SAs and FQs

2.3 上转换免疫层析技术

上转换纳米粒子（Upconversion nanoparticles，UCNPs）是指受到光激发时，通过多光子机制发射比激发波长短的荧光的纳米材料[50-51]，其基本组成包括基质材料、激活剂和敏化剂。由于UCNPs独特的发光机制，长波长激发短波长发射，相较于传统的有机染料作为生物标记材料，具有如下诸多优点[52-57]。（1）不易被光漂白，光化学性质稳定性高；（2）发光性能稳定，不受外界干扰，特别适合复杂生物样本中的荧光标记；（3）长波长激发短波长发射，不遵循Stokes定律，可以大大降低背景的干扰，提高检测灵敏度；（4）可通过控制掺杂元素的种类和比例，获得不同发射波长，实现生物体系多组分同时检测。

王金鹏[58]和张扬[59]利用性能优良的上转换纳米粒子，构建了上转换免疫层析方法，并用于动物源性食品中喹诺酮类、磺胺类和沙丁胺醇等兽药残留的检体，借助于免疫层析检测的平台，设计了一种新型信号turn-on模式的量子点荧光猝灭免疫层析检测方法，并用于动物源性食品中磺胺喹恶啉兽药残留的快速检测，相较于传统胶体金免疫层析检测方法，提高了免疫层析检测技术的灵敏度[48]。在此基础上进行进一步研究，针对食品多种潜在有害物共同存在的现状，构建了基于量子点的多残留荧光猝灭免疫层析方法（如图4所示），用于动物源性食品中磺胺类和喹诺酮类兽药的检测，为免疫层析技术用于兽药多残留检测。利用上转换纳米粒子与胶体金之间的能量共振转移的原理，建立了基于上转换的荧光猝灭免疫层析方法，并成功应用于磺胺喹恶啉兽药的检测[48]。然而，目前的研究缺乏相应的精准的检测仪器，还没有实现真正意义上的全定量分析。后续工作将致力于便携式检测仪器的制造或完善，实现全定量分析，并把可靠新颖的检测方法带出实验室，真正应用于实际样品的现场快速检测。

3 基于磁性纳米粒子的免疫层析技术

磁性纳米粒子是新近发展起来的标记物，它是一种内部含有磁性金属氧化物，表面覆盖高分子有机材料的具有一定磁性和特殊性质的微球[60]。其作为标记物具有以下优势：第一，免疫磁珠经过功能修饰之后，抗体是通过化学键结合到磁珠表面的，与之前胶体金、乳胶颗粒等的物理吸附不同，这种结合相对牢固，不易受到温度湿度的影响，所以试剂的稳定性要远远优于胶体金、乳胶颗粒等颗粒标记物；第二，磁性纳米粒子具有的超顺磁性，在磁场中行为一致，响应性相同，呈现良好的单分散性，易于控制；第三，磁性材料只有在磁场中才会有磁性，而一般的生物样品几乎不表现出任何磁性。因此，检测时背景值比较低，对于一些复杂的体系，样品无需经过特殊处理即可得到较高的灵敏度，这一点非常适用于免疫层析技术的要求。目前，基于超顺磁性磁珠的免疫层析技术作为新兴的标记层析技术已经引起了研究者们的广泛关注。

吴科盛[61]建立了磁分散固相萃取结合胶体金免疫层析试纸条定量检测猪肉中克伦特罗的方法。结果显示，基于磁分散固相萃取的胶体金免疫层析试纸条定量检测法最低检测限为0.10 ng/mL，定量限为0.24 ng/mL，该检测方法应用于经LC/MS/MS确证为CLE阳性的9个实际猪肉样本检测，比对结果显示，本研究所建检测方法与确证方法的检测结果具有较好的相关性。胡寅[62]以磁性Fe3O4纳米粒子为材料，盐酸克伦特罗为检测对象，通过优化试验反应条件，研究建立了基于Fe3O4磁性纳米粒子的半定量胶体金免疫层析试纸条。结果表明，在优化条件下，该方法的检测灵敏度与传统的胶体金免疫层析试纸条相似，具有成本低、制作简单、使用方便、能半定量检测等优点。黄薇[63]建立了一种将免疫磁分离与免疫磁层析相结合的磁性免疫层析快速检测新方法，并将其用于氯霉素残留的快速检测。该方法以超顺磁性微球代替传统的胶体金作为信号标记物，即可以通过肉眼观察或光学比色法实现快速定性分析，又可以进一步利用超顺磁材料特殊的磁信号实现免疫层析技术的定量化检测。

此外，近来Razo等有科研工作者[64]将磁性纳米颗粒与胶体金通过生物素-链霉亲和素相结合作为双重信号放大系统（如图5所示），应用于免疫层析技术中检测马铃薯X病毒，克服了传统免疫分析技术前处理复杂、检测信号弱的缺点。然而，其在兽药残留检测中的应用还没有开展，因此，将其应用于兽药残留的检测具有潜在的研究价值。

图5 所建立的双重信号放大的免疫层析示意图Fig.5 Proposed lateral flow immunoassay（LFIA）scheme with double amplification

4 展望

免疫层析技术作为快速检测领军先锋发展迅猛，功能性纳米材料具有更大的比表面积或者特定的功能，将其应用于免疫层析技术中，对于提高方法的性能有很重要的作用。本文综述了近年来利用新型标记材料，如量子点、稀土发光材料、上转换发光材料、荧光素等作为信号标记物在免疫层析技术应用的研究进展，这些新型研究技术突破了传统胶体金免疫层析方法在灵敏度和稳定性等方面的不足，此外，配合新型信号读数设备，克服了胶体金免疫层析技术只能实现定性半定量的缺点，实现了目标物的全定量分析检测。

此外，近年来互补的核酸链之间的特异性结合，也被研究者应用于层析方法中。其中应用较为广泛的为核酸适配体（Aptamer），它是一种对特定靶标物如小分子、金属离子、生物大分子、细胞以及生物组织等具有选择性识别功能的单链DNA或RNA序列。闫娇[65]开发了一种基于适配体技术的快速检测氯霉素的荧光试纸条的方法，检测限可以达到1 nmol/L。该方法简单快速，无需特殊和复杂的仪器，为开发基于适配体技术的抗生素及其他污染物快速现场检测方法提供了一种新的思路，具有良好的应用前景。且与抗体相比，核酸适配体显示出设计灵活、容易化学合成和修饰、成本低廉、生化稳定性好等优点。

随着生物技术、纳米技术、光电技术的发展及各学科的交叉融合，会有越来越多的新型标记材料、新型目标捕获元件、新型检测模式以及新型便携化、微型化、自动化的定量检测仪器出现，用于改善现有层析技术的各项性能，为食品安全监控提供直接、有效的方法，实现科学、合理地监测动物源性食品中兽药残留，为食品公司提升食品生产单位的运行管理水平，减少事故的发生，为相关监察部门节省巨大的检测成本，从而创造巨大的间接经济效益，同时也为食品安全事业做出更大的贡献。