载脂蛋白E检测在病理科的应用与指导意义

聂艳绒，杜桂清，王秋红，邓桂霞，乔婷婷，马丹琦

北京京煤集团总医院 （北京 102300）

载脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）是一种富含精氨酸的碱性蛋白，在脂蛋白转化和代谢中起着重要作用。人体ApoE是由299个氨基酸残基组成，主要于血液的乳糜微粒（chylomicron, CM）及其残骸、极低密度脂蛋白（very low density lipoproteins, VLDL）及其残粒、中间密度脂蛋白（intermediate density lipoproteins, IDL）和部分高密度脂蛋白（high density lipoproteins, HDL）中存在[1-2]。其是LDL受体的配基,也是肝细胞膜CM及VLDL残骸受体的配基,在肝脏代谢中起重要作用,参与脂质的运输、储存及排泄,有修复组织和调节免疫等作用。研究表明, ApoE基因型别与人体高脂血症、肝病、冠心病及寿命长短等有关[3-5]。

1 病理科引入ApoE检测的意义

病理科是大型综合医院必备的科室，主要任务是在医疗过程中承担病理诊断工作，其诊断报告是明确的疾病而非影像描述，因此临床医师能根据病理报告决定诊疗原则、解释临床症状和明确死因。与其他诊断手段如B超、电子计算机断层扫描（computed tomography，CT）及常规放射检查相比，是医学界公认最可信赖、准确性最高的诊断手段。传统的病理检查有活体组织、术中冰冻切片、免疫组织化学、特殊染色、免疫荧光等，可为临床提供明确的病理诊断，确定疾病性质[6]。但这也使得病理科的主要职责和能力局限在了为临床确诊提供直接依据，而无法为未发病状态和未来情况提供诊疗依据和参考。通过将ApoE基因型检测引进病理科室日常检测范围，加深了病理科的检测范围及其提供的诊疗依据广度。

2 ApoE基因型检测方法与指导意义

ApoE基因型检测法是通过核酸提取与纯化和基因芯片法进行定性检测、评定和分析。

2.1 核酸提取与纯化

提取与纯化原理：通过专用的试剂，选择性地分离全血中的红细胞与白细胞，并通过离心方式将目的细胞沉淀，并将红细胞及其他细胞成分碎片等杂质留在清液中去除，获得的目的细胞再进行细胞裂解、纯化并释放核酸，从而达到提取基因组核酸的目的。

2.1.1 仪器

采用1.5 ml离心孔径高速离心机。

2.1.2 样本要求

（1）适用样本类型：全血样本；（2）样本采集：用乙二胺四乙酸抗凝采血管进行血样采集，切勿使用肝素抗凝血；（3）样本保存及运输：经上述处理后的待测样本可立即用于处理，或（-20±5）℃保存（3个月）。应避免反复冻融，减少溶血。样本运送采用冰壶加冰或泡沫箱密封进行运输，短时间（3 d之内）常温运输，有可能对核酸产生一定影响。

2.1.3 提取与纯化方法

（1）在1.5 ml离心管中加入200 μl提取液Ⅰ，充分混匀血样后，取20 μl血样，贴壁加至离心管中，涡旋或者其他方式充分混匀15 s。（2）将1 500×g离心5 min，为了便于后续的操作，离心时离心管放置开盖方向朝向轴心。（3）倒弃上层液体，留下约20 μl沉淀，操作时切勿让沉淀流走，否则将导致整个实验失败。各别血液沉淀颜色较浅，透过光线肉眼可见为一层较薄的灰白色贴壁细胞，倒弃液体操作时按开盖口方向进行。（4）加入60 μl提取液Ⅱ。涡旋振荡20 s以上，直至看不到沉淀。充分震荡混匀是关键，否则将导致整个实验失败。（5）在70 ℃下反应10～20 min。（6）在100 ℃下反应10 min，防爆盖。温度和时间是影响其后聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增效率的重要影响因素之一，要严格遵守操作规范。（7）将12 000×g离心5 min。DNA在上清中，扩增加样时取上清，提取后的DNA保存于2～8 ℃，并于24 h内使用。最终得到纯度合格的核酸样本，用于后续基因型检测。

2.2 基因芯片法

检验原理：采用PCR技术扩增的特定基因片段，再与芯片上特异性核酸探针杂交以检测特定的基因位点的序列，使基因芯片杂交信号放大至肉眼判读的水平，应用基因型检测试剂盒，可准确的检测出ApoE基因112位点和158位点的基因类型，并结合基因芯片摄像仪，使结果易于判读和更客观。

2.2.1 仪器

采用PCR扩增仪，基因芯片摄像仪。

2.2.2 检验方法

包括样品处理、目的片段的PCR扩增、基因芯片检测等过程。

2.2.3 基因芯片检测

（1）分别将洗涤液A、B用双蒸水稀释，均可放在15 ℃以上室温下存放。（2）将PCR扩增产物99 ℃加热5 min，迅速置于冰浴中5 min。（3）取10 μl上述冰浴中PCR扩增产物至50～60 μl直用型杂交液中，混匀；揭开芯片保护膜，将上液加入基因芯片孔中，覆盖芯片表面。（4）加样后的芯片在（55±1.5）℃水浴60 min，然后在室温下放置5 min，使其冷却至室温。（5）用预热至（55±0.5）℃的稀释洗涤液A浸泡芯片2 min，最后用空气将芯片表面液滴吹净或离心甩干，一定要迅速将表面液滴吹净。（6）取直用型BW反应液60～70 μl覆盖于芯片表面，并在常温下反应15 min。（7）用稀释洗涤液B洗涤芯片3次，用洁净空气吹净或离心甩干芯片表面。（8）将直用型显色液1～2滴滴加在干燥的芯片表面，并使其覆盖全片，避光常温下反应10 min。（9）用稀释洗涤液B迅速冲洗芯片3次，用洁净空气吹净或离心甩干芯片表面，应用芯片自动分析报告系统进行判读或数码照相后自行判读。

3 结果

检测内容：同时检测ApoE基因6个型别（E2/E2，E3/E3，E4/E4，E2/E3，E2/E4，E3/E4），最终进行检测数值判定。

检验结果解释：对ApoE基因6个型别的检验结果归为3大类，为ApoE2、ApoE3和ApoE4。其中ApoE2类型人群患老年痴呆、冠心病、脑梗死等疾病的风险较低，服用阿托伐他汀、普伐他汀等药品效果较好；ApoE3类型人群患老年痴呆风险略高，患心脑血管疾病风险较低，大量烟酒会增加冠心病的患病风险；ApoE4类型人群患冠心病、心肌梗死等疾病风险较高，服用辛伐他汀、普罗补考等药品效果较好。详见表1。

4 展望

通过ApoE基因型检测技术，能从深层次的基因角度出发，为诊疗者提供更科学和更有前瞻性的诊疗与指导。ApoE基因型检测在病理科的应用，能够进一步凸显和提高病理科在大型综合医院中的作用，对病理科的提升有着重大意义。

表1 ApoE分型及指导意见