微乳薄层色谱法对桑叶桑枝中活性成分的鉴别

孙 莲， 骈继鑫， 李 娟

(新疆医科大学药学院， 乌鲁木齐 830011)

桑树(MorusalbaL.)为多年生落叶性木本植物，乔木多，灌木少，其皮、叶、枝和果实都具有药用作用，桑叶(Foliummori)和桑枝(Ramulusmori)中含有多种活性成分，主要有黄酮类、生物碱类、挥发油、香豆素类、甾体类、三萜类和多糖类等[1]，具有清除氧自由基、降血糖、降血脂、抗粥样硬化和抗炎等药理作用[2-7]。微乳薄层色谱是以微乳液为流动相进行的薄层分析。微乳液是由表面活性剂、助表面活性剂、油和水按一定的比例混合而成的无色透明、低粘度的热力学稳定体系，与传统的薄层色谱法相比，具有灵敏度高、重现性及分离效率好、斑点圆而集中等优点[8-15]。本研究采用微乳液薄层分析法对桑叶和桑枝中的活性成分进行定性鉴别，为桑叶和桑枝的质量控制提供依据，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1仪器CAMAG LINOMA T5型半自动点样仪(瑞士卡玛公司)，CAMAG REPROSTAR 3型薄层色谱数码成像系统(瑞士卡玛公司)。

1.2试药绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号110753-200413)，芦丁(中国药品生物制品检定所，批号100080-200707)，东莨菪内酯对照品(北京宝赛希望生物科技有限公司，批号D-020-140728)，桑皮苷A(上海圻明生物有限公司，批号161112)，桑辛素对照品(上海圻明生物有限公司，批号161109)，纯度均>98%；其他试剂均为国产分析纯。

1.3药材桑叶和桑枝2017年5月采自新疆10个不同产地(1库车县、2乌鲁木齐市、3吐鲁番市、4库尔勒市、5哈密市、6阿拉尔市、7疏勒县、8和田市、9北屯市、10呼图壁县)，经新疆医科大学生药教研室帕丽达·阿不力孜教授鉴定为多年生落叶性木本植物桑(MorusalbaL.)的叶和枝。

2 方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1 供试品溶液的制备 称取桑叶、桑枝的干燥粉末各5.0 g，分别置于250 mL的锥形瓶中，加入85%乙醇100 mL，超声提取2次，每次30 min，合并提取液， 4 000 r/min离心5 min，将提取液浓缩至5 mL，备用。

2.1.2 对照品溶液的制备 称取桑皮苷A、绿原酸、芦丁、东莨菪内酯、桑辛素对照品各2.5 mg，置于10 mL的容量瓶中，用甲醇定溶至刻度，得浓度为0.25 mg/mL的混合对照品溶液。

2.1.3 显色剂的制备 称取5.0 g三氯化铝置于100 mL容量瓶中，用无水乙醇定溶至刻度，得5%的三氯化铝乙醇溶液，备用。

2.1.4 展开剂的配制 分别称取SDS、正丁醇和正己烷，按质量比27∶63∶10混合，加入不同比例的水，超声5 min，密封静置24 h，备用。

2.2微乳薄层分析

2.2.1 微乳展开剂含水量的选择 在SDS-正丁醇-正己烷的质量比(27∶63∶10)保持不变的条件下，按表1改变含水量，配制系列微乳液，将点样后的聚酰胺薄膜在不同微乳液中展开，取出晾干，均匀喷洒显色剂，366 nm下检视，当微乳展开剂的含水量为75%时，对照品和桑叶桑枝样品均能达到较好的分离效果，故选择含水量75%的O/W型微乳液作为展开剂，见表2。

表1 微乳展开剂中不同含水量的选择

表2 微乳展开剂中不同含水量的展开效果

2.2.2 微乳展开剂中SDS用量的选择 当含水量(75%)，助表面活性剂(正丁醇)-正己烷质量比保持不变的条件下，按表3分别取不同量的SDS，配制微乳展开剂，按照“2.2.1”项下的方法展开，366 nm下检视。当SDS用量为2.2 和3.2 g时，对照品和桑叶桑枝样品的分离都存在拖尾和显色不清晰的现象，当SDS的用量为2.7 g时，对照品和桑叶桑枝样品均能达到较好的分离效果，因此选择SDS-正丁醇-正己烷质量比为 2.7∶6.3∶1.0,见图1、2。

表3 微乳展开剂不同SDS含量的选择

SDS-正丁醇-正己烷=m(2.2∶6.3∶1.0) SDS-正丁醇-正己烷=m(2.7∶6.3∶1.0) SDS-正丁醇-正己烷=m(3.2∶6.3∶1.0)

SDS-正丁醇-正己烷=m(2.2∶6.3∶1.0) SDS-正丁醇-正己烷=m(2.7∶6.3∶1.0) SDS-正丁醇-正己烷=m(3.2∶6.3∶1.0)

2.2.3 微乳展开剂中助表面活性剂种类的选择 当含水量(75%)，SDS-助表面活性剂-正己烷质量比为2.7∶6.3∶1.0保持不变的条件下，按表4配制微乳展开剂，按“2.2.1”项下方法展开、检视，不同助表面活性剂(正丁醇、乙醇及甲醇)对展开效果的影响，当助表面活性剂为正丁醇时，对照品和桑叶桑枝样品均能达到较好的分离效果，因此选择正丁醇为助表面活性剂，见图3、4。

2.2.4 微乳展开剂中正丁醇用量的选择 当含水量(75%)，SDS-正己烷质量比保持不变的条件下，取不同质量的正丁醇，按表5配制展开剂，按“2.2.1”项下方法展开、检视，当正丁醇用量为6.3 g时，对照品和桑叶桑枝样品均能达到较好的分离效果，因此选择SDS-正丁醇-正己烷质量比为2.7∶6.3∶1.0，见图5、6。

表4 不同种类助表面活性剂的微乳展开剂

SDS-甲醇-正己烷=m(2.7∶6.3∶1.0) SDS-正丁醇-正己烷=m(2.7∶6.3∶1.0) SDS-乙醇-正己烷=m(2.7∶6.3∶1.0)

表5不同正丁醇用量的微乳展开剂

2.2.5 微乳展开剂中甲酸用量的选择 当含水量(75%)，SDS-正丁醇-正己烷质量比为2.7∶6.3∶1.0保持不变的条件下，选择微乳展开剂-甲酸(9.0∶0.5、9.0∶1.0、9.0∶1.5)为展开剂，按照“2.2.1”项下的方法展开、检视，当V(微乳)∶V(甲酸)=9.0∶1.0时，对照品和桑叶桑枝样品均能达到较好的分离效果，见图7、8。

SDS-正丁醇-正己烷=m(2.7∶:5.8∶1.0) SDS-正丁醇-正己烷=m(2.7∶6.3∶1.0) SDS-正丁醇-正己烷=m(2.7∶6.8∶1.0)

SDS-正丁醇-正己烷=m(2.7∶5.8∶1.0) SDS-正丁醇-正己烷=m(2.7∶6.3∶1.0) SDS-正丁醇-正己烷=m(2.7∶6.8∶1.0)

V(微乳液)∶V(甲酸)=9.0∶0.5 V(微乳液)∶V(甲酸)=9.0∶1.0 V(微乳液)∶V(甲酸)=9.0∶1.5

V(微乳液)∶V(甲酸)=9.0∶0.5 V(微乳液)∶V(甲酸)=9.0∶1.0 V(微乳液)∶V(甲酸)=9.0∶1.5

2.3微乳薄层鉴别系统验证实验分别吸取10批次不同产地的桑叶桑枝样品溶液2.5 μL及混合对照品2 μL，点于20 cm×10 cm 聚酰胺薄膜板上，以含水量75%， m(SDS)-m(正丁醇)-m(正己烷)=2.7∶6.3∶1.0，V(微乳液) ∶V(甲酸)=9.0∶1.0 为展开剂，366 nm下检视。在桑枝桑叶样品与对照品相应的位置上，显现出颜色相同的斑点，可鉴别出桑叶中绿原酸、芦丁和桑皮苷A3种成分，以及桑枝中桑辛素、绿原酸、东莨菪内酯和桑皮苷A4种成分，见图9、10。

(注：A.绿原酸；B.芦丁； C.桑皮苷A)

(注：A.绿原酸；B.芦丁； C.桑皮苷A)

3 讨论

微乳薄层色谱是以微乳液为展开剂的薄层分析法，与传统的薄层色谱的展开剂相比，得到的斑点更加清晰，且数目较多，低毒。微乳薄层还具有明显的荧光增强增敏效应，是桑枝桑叶中黄酮类等物质定性鉴别较为理想的方法。本实验对提取溶剂进行了筛选，分别以甲醇、95%乙醇、85%乙醇及70%乙醇为溶剂的超声和回流2种提取法。结果显示，以甲醇为溶剂的2种提取方法得到的提取物中，绿色素含量较大，斑点不清晰、有拖尾；以95%乙醇作为溶剂的2种提取方法得到的提取物中，红色素含量较大，斑点有拖尾；以70%乙醇作为溶剂的2种提取方法得到的提取物，分离后斑点较少、不清晰；只有以85%乙醇为溶剂的超声法得到的提取物中，色素含量少，分离后斑点数多、清晰。同上还考察了以乙酸乙酯、正庚烷、正辛烷、正己烷作为展开系统的油相时，对展开效果的影响，发现以正己烷为油相的微乳液作为展开剂时，分离效果最好。