内皮祖细胞治疗脑创伤的研究进展

谢川平，陈佳树，陈 天，赵格晶娃，宋灏哲，李力卓

创伤性脑损伤(TBI)多发生于青少年人群，且患者致残率较高，甚至危及生命，引起社会各界的关注[1]。TBI主要由于跌倒、交通事故、运动或枪伤造成[2]，随着创伤系统和急救技术的发展，脑创伤的结局已经有很大改善，除传统手术等治疗手段外还需要研究新的治疗技术，阻止甚至逆转脑创伤[3]。近年来，研究表明血管内皮祖细胞(EPCs)可维持血管稳态，并可在颅脑创伤后归巢、黏附、迁移至损伤部位，不断分化增值为血管内皮细胞，促进创伤区血管再生，保护血脑屏障的修复，更重要的是，还可通过分泌细胞因子保护神经元的再生[4-5]，为创伤性脑损伤的治疗提供了新的方向。

1 EPCs的作用及其机制

创伤性脑损伤后，脑创伤部位的神经血管损伤，神经细胞凋亡坏死，脑组织水肿，局部循环血流障碍，导致神经功能丧失[6]。而EPCs是一种具有内皮特征的高增殖能力的干细胞，除了可促进血管新生外，还可以促进神经的发生。

1.1促进血管新生的机制 EPCs是一种多能干细胞，Asahara 等[7]1997年初次从人的外周循环血中分离出来，并被确认是一种未分化并且可再生的细胞，可增殖分化中为血管内皮细胞，并在骨髓和血液中广泛存在[8]。研究者根据培养时间的长短将EPCs划分为早期EPCs和晚期EPCs，并发现这两种EPCs可介导不同的机制促进血管新生。Rehman等[9]通过分离血液中的EPCs发现在初期尽管EPCs增殖缓慢，但却能分泌大量促进血管再生的因子，如血管内皮生长因子(VEGF)和集落因子等。Urbich等[10]将人脐静脉内皮细胞和EPCs放置于相同条件下培养，发现EPCs的增殖和迁移速度明显增加，Huang 等[11]通过抑制VEGF的表达却可抑制EPCs功能活性，降低AKT/eNOS信号转导，而该信号通路可激活下游增殖信号通路，和血管再生密切相关，说明早期EPCs可通过分泌细胞生长因子促进血管的新生。

晚期EPCs由于激酶的作用导致入嵌合受体(kinase insert domain receptor，KDR)、血管内皮钙黏蛋白(vascular endothelial-cadherin，VE-cadherin)在细胞膜表面表达增加，研究表明主要介导以下两种途径促进血管增殖再生：(1)E-cadherin介导内皮细胞之间的黏附因子的表达。晚期EPCs可使得VE-cadherin分子的表达增加，促进自身更好地分化为单层内皮细胞，增加内皮细胞的数量，促进血管新生[12]；(2)KDR介导VEGF激活内皮细胞，晚期EPCs中KDR表达增强可诱导由VEGF介导的内皮细胞增殖，并且新生血管出芽及移行能力明显增强[13]。

此外，研究表明，Hippo信号通路在EPCs的增殖分化中扮演重要角色，其信号通路组成MST1/2可促进EPCs自我分化，并且其下游YAP的高表达与EPCs的增殖成正相关，提示Hippo通路也许是EPCs增殖的又一新的机制[14-15]。

1.2促进神经发生的机制 EPCs可分泌细胞因子促进脑创伤中周围神经发生。Rosell等[16]通过静脉将含EPCs分泌因子的培养基注射入一侧大脑中动脉闭塞的大鼠中，与未注射EPCs分泌因子的动脉闭塞大鼠相比，大脑梗死周围的轴索重组和神经迁移更明显，由此可推断，正是EPCs分泌了某种细胞因子促进神经发生。另外，EPCs也可通过促进血管再生保护神经元的存活。Park等[17]发现脑创伤后，体外EPCs移植可保护损伤的毛细血管破裂，并保护神经元的功能。而Xue 等[18]发现EPCs移植后可降低大脑创伤边缘区的炎症细胞聚集，抑制星型胶质细胞的形成，减少瘢痕的形成，有利于大脑创伤区神经元的修复。这些实验可充分说明EPCs可通过自身分泌的细胞因子并促进血管再生，保护神经元的存活，在脑创伤修复中发挥着重要作用。

2 以EPCs为基础的治疗方法

以EPCs为基础的治疗脑创伤的方法主要包括以下几种：外源性EPCs移植治疗；药物或激素刺激内源性EPCs的表达；EPCs外泌体移植治疗。

2.1外源性EPCs移植治疗脑创伤 大量动物实验研究证实，外源性EPCs移植在治疗脑创伤中发挥重要作用，并已经取得良好的疗效。Park等[19]将EPCs植入创伤性脑损伤的大鼠中，通过测量caspase-3的表达和创伤区毛细血管的密度和神经元的数量，观察在急性期和亚急性期脑创伤大鼠中，EPCs移植对血管再生和神经恢复的作用。结果发现，EPCs移植组在急性期(72h)caspase-3表达的下降，毛细血管和神经元恢复明显增强，大鼠行为评估也较未移植组有明显改善，尽管相对于亚急性组(30d)改善程度不明显。这说明EPCs移植可通过抑制细胞凋亡并促进血管再生,显著改善脑创伤早期阶段。并且， Yu等[20]发现通过用孕酮刺激EPCs生成有利于TBI大鼠损伤区血管形成和神经恢复，并且孕酮含量和脑损伤的恢复成正相关，这些实验在一定程度上说明EPCs可有效改善脑创伤区域血管形成和神经元恢复。

此外，EPCs移植不仅有利于脑创伤区血管和伸进恢复，对于脑卒中也有相类似的作用,可促进脑梗死周围血管再生，并修复神经元，大脑功能评估包括行为记忆测试也较未创伤组有所提高[21]。并且已有研究证实，不仅在神经系统，在心肌、肺脏、肾脏损伤中也均可发挥血管再生的作用[22-24]，EPCs移植治疗各系统创伤性疾病有着广泛的前景。

2.2内源性EPCs的动员治疗脑创伤 除了外源性EPCs移植外，也有研究表明可通过促进内源性EPCs的增殖和活化迁移至脑创伤区域，改善创伤区神经功能。杨莹莹等[25]分别将生理盐水和不同浓度的雌激素(10nmol/L、100nmol/L、1μmol/L)和雌激素抑制剂用于某医院治疗急性期脑出血患者，通过测定EPCs细胞的VEGF表达间接反映EPCs的数量，研究表明EPCs的数量在注射雌激素后，增加有统计学意义， EPCs数量随着雌激素的浓度增加而增加。并且，EPCs的增殖和迁移能力也明显提高，而雌激素抑制剂组则相反。这一现象在患者中也得到证实，注射雌激素组患者脑功能恢复也明显高于未注射雌激素患者，至少在急性期有显著差异。此外，Wang 等[26]发现孕酮可增加脑创伤后循环血液中EPCs的数量，促进大鼠脑血管EPCs增殖和神经元再生。除了雌激素和孕酮外，研究发现，在创伤性大鼠中，重组红细胞生成素可通过趋化因子CXCR4促进EPCs向创伤区聚集[27]，促进创伤区血管新生并显著提高大鼠的认知水平[28-29]。总之，动员内源性EPCs治疗脑创伤现已不仅证实在大鼠中起保护作用，在临床中治疗脑出血患者也被证明产生积极作用，可给治疗脑创伤提供又一个有效的解决方案。

2.3EPCs外泌体移植治疗脑创伤 EPCs可分泌外泌体，内含丰富的RNA和分泌蛋白。李飞[30]通过尾静脉向创伤小鼠注射EPCs外泌体后，发现移植EPCs外泌体后脑创伤灶局部血管新生增强，脑组织灌流量增加，神经修复加快。研究外泌体表明主要是通过以下机制来保护脑组织：外泌体可增强血脑屏障间的紧密连接程度，而其完整性有助于减轻脑组织水肿程度，减少神经细胞凋亡；可促进大量VEGF的分泌，诱导血管再生；通过促进基质金属蛋白酶(MMP9)表达的升高，诱导血管新生以及重塑、创伤愈合；外泌体能减少PTEN(一种抑癌基因，可抑制细胞快速生长)表达，促进血管新生[31]。

此外，研究表明，EPCs的外泌体在中枢神经中也发挥重要作用，外泌体内MicroRNA-133b可促进神经元生长[32]，并有利于神经细胞之间的信息传递，促进突触的形成[33]。因此移植外泌体也许是治疗创伤性脑损伤的另一个更好的选择，且单纯移植外泌体可避免细胞移植的不良反应，更为安全有效[34]。

3 应用EPCs治疗脑创伤的预测价值

EPCs对脑创伤的预测价值主要体现在EPCs作为脑血管功能的标志物对脑创伤严重程度进行判断。王计伟等[35]通过对不同程度脑创伤大鼠外周EPCs动态变化分析，发现轻、中、重度脑创伤3h后，循环中EPCs数量明显低于未创伤组，而伤后6h，EPCs数量明显高于未创伤组，约48h恢复正常，这种动态变化可能是由于循环血中EPCs向创伤灶归巢所致，使得6h后EPCs数量明显升高，有利于创伤修复。Guo等[36]研究证实，静脉输注体外培养的EPCs可选择性地归巢到脑创伤部位，而不归巢至正常脑组织中， 有利于血管修复和神经元再生。且研究发现，轻度脑创伤6h后EPCs数量显著高于重度脑创伤，提示高水平有助于提高脑创伤后认知能力的恢复。总而言之，脑创伤循环血EPCs的水平与疾病的发生发展密切相关，可作为判断预后的标志物[35]。

4 应用EPCs目前存在的挑战

尽管EPCs治疗脑创伤的作用机制和治疗效果已经取得一定的进展，并且已经有相关的临床试验，但仍然有些问题尚待解决：(1)移植干细胞可以恢复功能缺陷，但也可能引起宿主体内的免疫排斥反应[37]；(2)利用EPCs在临床治疗急性脑出血患者中，仅表现出急性神经和血管恢复，对于长期的改善并无显著差异[19]；(3)Sun等[38]利用自体干细胞治疗缺血性脑创伤患者虽然未发现不良反应，改善作用也不明显。尽管现在大多数实验尚处于动物模型阶段，如何能避免不良反应并应用于临床还有一定距离，但大量实验研究表明，EPCs移植对于治疗脑创伤有着广泛的前景和治疗潜力。