抗性淀粉及其遗传改良研究进展

(长江大学农学院，湖北 荆州 434025)

丁保淼

(长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025)

王容，胡倩文，张文英

(长江大学农学院，湖北 荆州 434025)

淀粉作为食物中的主要成分，按照其在人体小肠中被消化吸收的快慢分为快速消化淀粉、缓慢消化淀粉和抗性淀粉(Resistant Starch，RS)[1]。RS是α 1, 4 D-葡聚糖的线性分子，主要来源于退化的直链淀粉，不像普通淀粉那样易被快速消化。一般情况下，淀粉中的RS含量与其直链淀粉含量之间有极强的相关性。Granfeldt等[2]在谷类食品的研究中发现，高直链淀粉的谷类食品RS含量为20%，比普通淀粉的谷类食品高17%，高直链淀粉的产品具有生产高RS的潜力。Morita等[3]在玉米淀粉的研究中也说明了上述两者之间有很强的相关性。有研究通过提高直链淀粉含量来获得高RS含量[4,5]。但在豌豆这个作物中，上述两者的相关性不明显，直链淀粉含量处于中等，而RS含量非常高[6]。

RS因具有降低胰岛素反应、缓解糖尿病、控制体重、促进矿物质离子的吸收等多种生物学功能而受到广泛关注，在人体的健康上具有广阔的应用前景。笔者主要从RS的类型、生理功能、测定方式以及抗性淀粉的遗传基础与改良等方面进行综述，以期为RS的研究与应用提供参考。

1 RS的定义与分类

目前普遍接受的RS定义是“健康者小肠中不被吸收的淀粉及其降解物”[7]。早期RS的分类包括3种类型，即RS1、RS2和RS3，近些年又将RS4和RS5这2种类型列入其中[1,8,9]。

RS1为物理包埋淀粉。可能是由于谷粒、种子或者块儿茎中存在完整的细胞壁，但由于肠道中缺乏细胞壁降解酶，导致其不能降解细胞壁成分，从而产生了物理屏蔽作用，或者是因为蛋白质的存在使淀粉酶不能与其接触，从而不能产生消化作用。

RS2为天然淀粉颗粒，通常存在于薯类和生香蕉中，因其结构紧凑，淀粉酶和消化酶不易与其接触[10]，RS2对淀粉酶具有强的抗性。具有高直链淀粉的玉米淀粉就是一种RS2，即使在食品加工和制备过程中仍然保持着其结构和抗性。RS2又分为3种结晶类型(A、B、C)，其中B型结晶的抗性更强[11]。RS1和RS2经过一些加工处理可以再次被淀粉酶消化[12]。

RS3称为回生淀粉，是退化或重结晶的直链淀粉，主要在糊化淀粉的冷却过程中形成，也可在保持低温或室温的熟食中形成。淀粉糊在低温下储存一段时间，可获得具有高度热稳定性的由直链淀粉双螺旋聚集而形成的B型晶体结构，而在沸腾温度下储存则表现为A型结晶[13]。直链淀粉形成的结晶称为RS3b，比支链淀粉形成的部分结晶具有更高的抗酶解性，而支链淀粉的结晶过程缓慢，经55～70℃的温度加热处理后，可被淀粉酶降解，称为RS3a[14,15]。RS3作为抗性淀粉的重要组成部分，受到了国内外研究者的广泛关注[13]。

RS4称为化学修饰淀粉，主要是一些化学修饰及官能团的取代改变了淀粉分子的组成和结构，从而对淀粉分解酶具有抗性，例如磷酸化淀粉、羟丙基二淀粉、乙酰化淀粉以及几种官能团的共同作用等。并有研究表明，被取代淀粉的抗性随着取代度的增加而增加[16]。

RS5是直链淀粉-脂质复合物，它是由直链淀粉内部的非极性区和脂质之间的疏水性区域的相互作用而形成的一种单螺旋包接结构[9]，其主要是通过促进短链脂肪酸的形成，从而对α-淀粉酶产生抗性。

2 RS的生理功能

2.1 控制血糖，防治糖尿病

血糖生成指数(Glycemic Index,GI)反映了食物最初消化和葡萄糖吸收的应答关系，即可以反映食物对餐后血糖的影响大小。RS的GI值比正常淀粉低，能有效降低人体餐后的血糖水平[17]，有研究发现长期摄入含有RS的食物不仅能够降低糖尿病患者血糖水平，也能使健康人群的餐后血糖水平有所改观[18,19]。

2.2 对肠道的调节作用

RS对肠道的调节作用主要是通过在结肠中细菌发酵产生短链脂肪酸(short chain fatty acids,SCFA)。其中丁酸作为结肠膜细胞的主要能量来源，会被结肠膜细胞优先转运[20]，可使肠道细胞的代谢和转化得到抑制，从而降低结肠癌的发病风险[21]。此外，SCFA能够通过降低肠道pH而对肠道起到净化作用[22]。另外，RS作为一种益生元，选择性地刺激结肠中的一种或是几种益生菌物种的生长或活性，从而改善宿主健康[15]。

2.3 防止脂肪堆积，有利于控制体重

许多研究已经表明，RS能降低各种脂蛋白及总脂质和胆固醇的含量，通过给大鼠喂食含有25% RS含量的生马铃薯，显著提高了盲肠大小以及短链脂肪酸(SCFA)在结肠中的吸收[23,24]。此外，在大鼠中观察到所有脂蛋白组分中胆固醇浓度的降低，高密度脂蛋白和甘油三酯的浓度降低尤为明显[25]。Lopez等[24]研究指出用RS代替膳食中总碳水化合物的5.4%，能使餐后脂类的氧化水平显著提高。Aziz等[26]通过高RS含量食品喂食肥胖大鼠试验，发现可显著降低其体重，证明了RS具有控制体重的作用。

2.4 促进矿物质的吸收

RS可以提高人体和大鼠中对一些矿物质的回肠吸收。研究表明，RS可提高人类对钙的吸收率，以及RS可提高大鼠对钙、镁、锌和铜等矿物质的吸收效率[27]。RS促进无机盐吸收的原因可能是SCFA使盲肠壁变得肥大，增大了无机盐吸收的表面积，从而使各种无机离子的吸收能力增强[28]。

3 RS的测定

目前，AOAC 2002.02作为RS测定的国际标准在全球的谷类作物中通用。这是体外测定方法中的一种，其基本原理是根据RS的抗酶解性去除可消化淀粉，再根据RS溶于氢氧化钾或者是二甲亚砜溶液能被淀粉酶溶解，从而间接测定抗性淀粉含量，因其结果可靠、实验重复性好而被广泛接受，是目前测定RS含量最常用的一种方法。但该方法繁琐、耗时、成本高，越来越多的研究者开始研究简单、快速、准确的抗性淀粉测定方法。

近红外光谱(near-infrared reflectance spectroscopy，NIRS)分析技术是一项简单、准确且高效的物理检测技术，根据被检测样品中某一化学成分对近红外区光谱的吸收特性进行定量测定[29]。通过多种分析技术的综合应用，例如被测物质的浓度或是其他各种性质的分析技术、近红外分析技术和化学计量学光谱软件技术，建立各种组分含量和近红外光谱有关的定标模型，从而通过被测样品的近红外光谱就可快速预测出相关数据。在RS含量测定的应用上，已在甘薯[30]、马铃薯[31]、水稻[32]中有所报道。

傅里叶变换红外光谱(Fourier Transform infrared spectroscopy，FTIRS)分析技术被广泛应用于单糖(葡萄糖、果糖)、多糖[33](麦芽糖、蔗糖、果聚糖)、蛋白质、脂肪[34]等成分的含量测定。FTIRS在400～4000cm-1的光谱范围内，峰型较尖锐，对化学键的振荡频率敏感。通过实验数据将FTIR上的谱带吸光度与不同化学键的振动模式进行匹配，峰强度的变化可表明由于链长度和结晶度改变而引起的淀粉结构构象变化，而吸收带幅度的变化可以用来精确地表示RS形成过程中内部和分子间氢键的组合[15]。与天然淀粉相比,分析各种来源RS的FTIR光谱发现，其化学基团没有发生变化，但某些谱带的吸收强度和振动幅度却有所不同。例如通常使用1047cm-1/1022cm-1和995cm-1/1022cm-1处的吸收带积分面积的比率来量化RS的结晶度和分子顺序，1047cm-1/1022cm-1和995cm-1/1022cm-1比率越高，表明淀粉颗粒中结晶区域所占比例越高[35～37]。莲子籽RS在995cm-1/1022cm-1的光密度比率(1.00)比天然淀粉(0.87)高，表明微晶的存在是由有序的淀粉链形成的。此外， RS在800～1200cm-1范围内的吸收强度(C—C、C—OH和C—H伸缩振动)均比原生淀粉弱，说明莲子RS发生了构象变化[37,38]。高直链淀粉的RS比消化前的淀粉具有更高的1047cm-1/1022cm-1比率[36]。从退化的玉米饼中分离的RS中的—OH带(～2930cm-1)比天然淀粉更明显，且在RS中发现羧基带(1743cm-1)与玉米淀粉的对照谱相比更显著[39]。以上结果说明了FTIRS技术不仅可以通过化学基团及其特征对待测物质进行定性分析，也可以和NIRS技术一样通过建立相关模型从而对待测物质进行定量分析。

配有折射率检测器的高效凝胶排阻色谱(High performance size exclusion chromatography，HPSEC)可用于RS分子量的测定。淀粉的重量平均分子量(Mw)和数量平均分子量(Mn)比值表示多分散指数(Mw/Mn)，多分散指数的值越大，分子量分布越宽[37]。通过使用SEC结合多角度光散射和折射率检测器，经过压热法、微波法和超声波辅助压热法制备的纯化莲子RS的分子量分布在小于2×104g/mol的范围内，所占的比例为86.6%～89.9%，而分子量范围在(2～3)×104g/mol和大于3×104g/mol的范围内所占的比例分别为5.6%～7.3%和7.0%，通过这些处理制备的RS的Mw/Mn在1.247和1.298之间，表明RS样品具有相对窄的分子量分布[38]。聚合度(Degree of Polymerization，DP)表示每个聚合物链的葡萄糖单元数。分子量或DP的数据可以通过在HPSEC中的具有不同摩尔质量范围的累积重量分数的多组分DP的组合峰而获得。

4 RS的遗传基础

4.1 RS的形成过程及影响因素

RS主要是由大量直链淀粉和少量极限糊精回生聚合而成，淀粉糊化后，其晶体结构发生改变，打乱后的淀粉分子在冷却过程中再重新聚合、卷曲、折叠，形成新的晶体。

已有报道指出高直链淀粉对RS的生成有积极作用[4,5]，热湿处理的蜡质马铃薯抗性淀粉(HMT-RS)中分离出的RS与HMT马铃薯淀粉和HMT-RSC(快速消化淀粉)+SDS(缓慢消化淀粉)相比，具有较高比例的长链(聚合度DP≥37)和较低比例的短支链(聚合度DP为6～12)，在淀粉回生过程中支链淀粉分子中大量短链中断了具有酶抗性的微晶形成，而具有少量短链和大量长链的支链淀粉分子优先形成相对完美的抗消化微晶[40,41]。相对合适的DP有益于形成双螺旋和结晶[42]。链长为30～40个葡萄糖残基似乎是形成RS的必要条件。另外有研究表明，少量脂类的存在对RS的形成也具有积极影响，即可提高RS的产率[43]。

4.2 淀粉形成的生物学基础

淀粉合成关键酶的种类、功能及在许多作物上的研究进展已被许多研究者所报道[44]。淀粉合成关键酶对RS的形成及含量的影响成为研究热点。目前以下几种酶被发现对RS的形成具有一定影响。

4.2.1 可溶性淀粉合成酶(SSS)

SSS具有SSSⅠ、SSSⅡ和SSSⅢ 3种同工酶类型。研究表明这3种同工酶分别负责短链、中等长度和长链淀粉的合成[45]。玉米、小麦、水稻等作物的SSS同工酶基因已经基本被定位，如Jiang等[46]将水稻中编码的SSS的基因定位在第10、2和6号染色体上。Zhou等[47]采用基于图谱的克隆方法，首先将鉴定出的和RS形成有关的突变体b10基因定位于8号染色体上，然后对412株植物进行大规模连锁分析，又将基因定位在M6和M8标记之间的456kb区域，通过Gramene数据库的筛选，发现了1个有缺陷的可溶性淀粉合成酶基因(SSⅢa)，负责RS的产生，且纯合突变体ssⅢassⅢa植物具有5.8%的RS含量，是野生型R7954植物(SSⅢaSSⅢa)的3倍，接下来又证明RS的产生依赖于颗粒结合淀粉合成酶Waxya(Wxa)等位基因的高表达，它们共同调节水稻中的RS生物合成，且发现纯合ssⅢa突变体与纯合籼稻WxaWxa等位基因组合产生更高RS含量(6.1%)，这一发现为提高米饭中尤其是在亚洲南部占主导地位的籼米中RS含量，带来了可喜的前景。

4.2.2 淀粉分支酶(SBE)

不同的植物类型对SBE命名不同，小麦、水稻、玉米等谷类作物中常用SBEⅠ和SBEⅡ(SBEⅡa和SBEⅡb)命名，在豌豆和马铃薯等中常以B(SBEⅠ)和A( SBEⅡ)来命名[48]。玉米同工酶SBE Ⅰ和SBE Ⅱ分别负责中等、长链和短链葡聚糖的合成[49]。大麦中SBEⅡa和SBEⅡb的编码基因和小麦中SBE Ⅰ的主效基因分别被定位于第2、5号和7D染色体的短臂末端[50,51]。Carciofi等[52]通过协同沉默所有SBE基因发现大麦籽粒胚乳内只产生直链淀粉，且在仅含直链淀粉的天然淀粉、凝胶化淀粉和退化的淀粉中RS含量分别为90%、65%和68%，远超过煮熟的香蕉和马铃薯中的RS含量(30%)。Hazard等[53]通过SBEⅡa-A敲除突变和SBEⅡa-B剪接位点突变的小麦双突变体使直链淀粉含量增加22%(P<0.0001)，抗性淀粉含量增加115%(P<0.0001)。

4.2.3 淀粉脱支酶(DBE)

DBE主要用于调节分支以及维护支链淀粉的结晶度[54]。DBE根据催化底物的不同可分为异淀粉酶(ISA)和极限糊精酶(ZPU)，后者在淀粉合成过程中起着某种程度的补偿作用[55,56]。编码这2种酶的基因都是单拷贝基因，在玉米、水稻、小麦等植物中发现编码ISA的基因位于su1位点[57,58]。另外，异淀粉酶被认为对抗性淀粉的形成有一定的影响，一种来自珊瑚菌菌株EGB的新型脱支酶Iso M，是一种典型的异淀粉酶，研究发现，RS含量可以随着Iso M处理的分支时间的增加而增加，并且在I U Iso M处理24h时达到最大值(70.9%)，这与来自支链淀粉酶(Promozyme®D2)处理的73.9%RS含量相当，有效的脱支活动使Iso M成为生产RS的候选者，同时，基于异淀粉酶和α-淀粉酶在淀粉中形成麦芽低聚糖的特点， Iso M可以在淀粉加工中与其他淀粉分解酶结合使用[59]。

5 RS的遗传改良

近10年来，国内外育种者通过辐射诱变、化学诱变等方法来创造具有高RS含量的改良新品种，并取得了初步成效。

Zhou等[47]为了找到RS的新基因，通过筛选γ-辐射的杂交稻恢复系R7954，鉴定了1种突变体b10， 在熟米中有高的RS含量。Bai等[60]通过CRISPR/Cas9技术对水稻中SBE3基因编辑，发现了2个纯合突变体，其RS含量高达10%。化学诱变的使用得到了1个RS含量较高的裸大麦品种Himalaya 292[61]。Carciofi等[52]通过沉默所有SBE基因，发现大麦籽粒胚乳内只产生直链淀粉，且仅含直链淀粉的天然淀粉中有高含量的RS(90%)。张志转[62]通过对苏麦6号干种子诱变，在M3代中筛选鉴定了1个RS含量较高且表达稳定的突变株系，在M4代中分析发现其RS含量比苏麦6号高7倍，定名突变体WRS-1。张贞彩[63]通过使用EMS诱变技术进行RS材料的筛选，其中含量最高的材料为M08412-5。高直链淀粉玉米GEMS-0067品系是由谱系GUAT209：S13×(H99ae×OH43ae)的F5衍生系内的同胞交配获得的[64]，其是隐性直链淀粉扩充基因(ae)和未知的高直链淀粉修饰基因(HAM)的纯合突变体，它产生的RS含量比玉米ae单突变体高约25%[65]。Lee等[66]的研究表明适当剂量的辐射可以显着增加玉米淀粉中的RS含量。

6 展望

摄入RS含量越高，越有助于提高人们的健康水平，然而普通热米饭中RS含量少于3%[25,67]。基于RS的诸多益处，若增加谷物中RS的含量，不仅能为糖尿病患者提供高质量的食物，也有助于提高人群的健康水平。在当今时代中，人们比以往任何时候都更容易出现与生活方式有关的疾病，增加RS的摄入量是对抗这些疾病的健康方式[68]。但目前RS含量较高的作物新品种还不够丰富，遗传机理的研究也不够深入，还需要在RS遗传改良的路上走的更远。基因组编辑技术的应用，与常规育种、化学或物理辐射诱变以及转基因技术相比，可以以简便的方式更精确地修饰靶基因，产生定向诱变[69]，而且不需要复杂的回交和杂交，节约了大量的时间，在作物改良中具有相对的优势。Sun等[70]使用CRISPR / Cas9介导的基因组编辑技术在水稻的SBEⅠ和SBEⅡb中产生定向诱变，并成功地获得了直链淀粉含量(25.0%)和RS含量(9.8%)显著增加的无转基因的纯合sbeⅡb突变体，这可能对其他谷类作物的RS生物合成具有一定的参考意义。另外可以结合突变体库的创制，利用分子辅助标记育种等快速准确的技术加快新产品的快速利用。