水杨酸和茉莉酸甲酯对安络小皮伞菌生长及多糖产量的影响

(长江大学生命科学学院，湖北 荆州 434025)

安络小皮伞菌(Marasmiusandrosaceus)是我国传统的药用真菌，野生种质主要着生于湿润多雨的枯木落叶上[1,2]。现代医学中培养其菌丝体，经抽提，制成止痛浸膏或胶囊，具有止痛消炎等功效，对三叉神经痛、坐骨神经痛、面神经麻痹、偏头痛和风湿性关炎等疗效较好；对中轻度麻风神经痛、腰肌劳损等也有缓解作用[3～6]。而安络小皮伞多糖是安络小皮伞菌的重要活性物质之一[5,6]，更是具有抗高血压、免疫调节、清除自由基、抗脂质过氧化、镇痛、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗慢性肝炎等多种功效[5～9]，因此，怎样增加其多糖的提取量十分关键。目前，主要采用诱变技术、优化培养基和优化提取工艺提高安络小皮伞多糖的提取量[10～12]。

茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate, MeJa)是一种植物生长调节物质，在植物中广泛存在，作为植物抗病信号传递体之一，影响了局部或系统的抗性[13]；作为与损伤相关的植物激素和信号分子，外源应用能够激发防御植物基因的表达，诱导植物的化学防御，产生与机械损伤和昆虫取食相似的效果[14]。水杨酸(Salicylic Acid, SA)是一种植物体内产生的具有生理调节作用的酚类化合物，作为重要的信号分子，可以诱导逆境相关蛋白的表达、激活植物超敏反应和系统获得抗病、抗旱、抗冷的特性以及调节细胞抗氧化机制等[13～15]，从而提高植物对逆境胁迫的耐受能力。

植物激素不仅对植物生长具有重大的调节作用，而且针对灵芝等大型真菌生理反应也存在一定的调控作用[16]。为此，笔者在安络小皮伞液态发酵过程中添加水杨酸或茉莉酸甲酯后，考察了这2种激素对安络小皮伞菌(Marasmiellusandrosaceus)的生物量及多糖含量的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

安络小皮伞菌由湖北欣恺生物有限公司提供，长江大学生命科学学院微生物实验室保藏。

1.1.2 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂(Potato Dextrose Agar, PDA)固态培养基：马铃薯200g，15～20g琼脂，葡萄糖20g，水1000mL，自然pH。

马铃薯葡萄糖液态培养基(PDB)：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL。

1.1.3 主要药品与试剂

包括葡萄糖、琼脂、3,5 -二硝基水杨酸、茉莉酸甲酯、乙醇、苯酚(重蒸)、浓硫酸等，均为分析纯级。

1.1.4 主要仪器与设备

SPX-250B-Z生化培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；BS-IE振荡培养箱(国华电器有限公司)；HFsafe-1200超净工作台(上海力申科学仪器有限公司)；HVE-50立体式高压灭菌锅(上海三申医疗器械有限公司)；HH-4恒温水浴锅(国华电器有限公司)；UV-1800紫外分光光度计(日本岛津公司)；DL-5-C高速冷冻离心机(上海市离心机械研究所)；ET-2010KA立式双门回旋摇床(金坛市亿通电子有限公司)；YE4A349120移液枪(北京金花仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌种的培养

将保藏的安络小皮伞菌种接入含100mL的PDA培养基的250mL三角瓶中，25℃恒温培养7d，存冰箱中备用。

1.2.2 孢子悬液的制备

20mL无菌蒸馏水加入到250mL三角瓶斜面培养基上，用接种环将培养基斜面上的孢子轻轻刮下，倒入带有4层擦镜纸的灭菌漏斗中过滤，然后将过滤的安络小皮伞菌液倒入盛有灭菌小玻璃珠的50mL三角瓶中，25℃、150r/min震荡15min，将孢子充分打散，得到均匀的单孢子悬液。

1.2.3 水杨酸和茉莉酸甲酯对安络小皮伞菌产多糖的影响

将先配制好的0.1mol/L的水杨酸/茉莉酸甲酯溶液，向培养基中分别按梯度加入水杨酸 (0、10、50、100、250、500、750、1000μmol/L) 或者茉莉酸甲酯(0、10、30、50、70、90、110μmol/L)(此浓度为培养基中的终浓度)。经此初选后，再复筛水杨酸 (650、700、750、800、850μmol/L) 或者茉莉酸甲酯(80、85、90、95、100μmol/L)的浓度，确定促进安络小皮伞菌胞内多糖(Intracellular polysaccharide,IPS)和胞外多糖(Extracellular polysaccharide, EPS)产量最大的浓度。每个梯度做3个平行试验组。

1.2.4 水杨酸和茉莉酸甲酯对菌株生长的影响

将得到的菌悬液吸取2mL菌悬液加入到灭菌过的装有100mL PDB液体培养基的250mL三角瓶。将加入800μmol/L水杨酸和90μmol/L茉莉酸甲酯的菌悬液分别作为处理组与对照组一起放入恒温摇床中，25℃、150/min培养14d。每隔2d测1次生物量，记录安络小皮伞菌株的生物量的变化。

1.2.5 多糖含量的测定

多糖含量的测定采用苯酚硫酸法[5]。

1)葡萄糖标准曲线绘制 葡萄糖标准曲线绘制方法参照文献[5]，得出溶液在490nm处的光密度(x)与标准葡萄糖溶液浓度(y,mg/mol)的回归方程:y=4.1964x+0.06746，决定系数R2=0.99937。

2)样品中多糖含量的测定 样品中IPS浓度的测定：分别收集发酵后的菌丝体，蒸馏水清洗后进行干燥至恒重，称取并记录菌体的生物量，取0.03g充分水浸醇沉后溶于5mL蒸馏水，取1mL稀释至5mL，后取2mL参照葡萄糖标准曲线绘制的方法在490nm 处测定溶液的光密度，并代入回归方程算出浸提液浓度，计算IPS的产量(mg/g)。

样品中EPS含量的测定：收集发酵液(100mL)，取1mL发酵液醇沉，沉淀溶解于5mL蒸馏水中，再取1mL稀释至5mL，后取2mL参照葡萄糖标准曲线绘制的方法在490nm处测定溶液的光密度，并代入回归方程算出浸提液浓度，计算EPS的产量(mg/100mL)。

1.2.6 安络小皮伞菌生物量的测定

安络小皮伞菌生物量采取菌体干重法测定[8]。将安络小皮伞菌发酵液全部转入离心管中，10000r/min的条件下离心4min，过滤得到安络小皮伞的菌体组织。称重记录其湿重再放入60℃的烘箱中烘干。每隔5h测1次净重，直到重量不发生变化为止，此时的重量即为菌体的净重。

2 结果与分析

2.1 水杨酸对安络小皮伞菌产多糖的影响

不同浓度水杨酸下安络小皮伞菌的多糖产量如图1所示。由图1(a)可知，当水杨酸浓度高于10μmol/L后，随着水杨酸浓度的增加，IPS和EPS产量也在增加；在750μmol/L浓度时，两者的产量到达一个峰值，分别为151.12mg/g和485.58mg/100mL。再以750μmol/L为中心，进行小范围复筛水杨酸促进安络小皮伞菌多糖产量的最适浓度，其结果如1(b)所示。由图1(b)可知，在水杨酸浓度为800μmol/L时，2种多糖产量均达到峰值，即此浓度为水杨酸对安络小皮伞菌细胞产IPS的最佳促进浓度，此时IPS产量为158.36mg/g，较对照组增长了52.82%； EPS产量为497.65mg/100mL，较对照组增长了60.53%。

图1 不同水杨酸浓度下的胞内外多糖产量

2.2 茉莉酸甲酯对安络小皮伞菌产多糖的影响

不同浓度茉莉酸甲酯下安络小皮伞菌的多糖产量如图2所示。由图2(a)可知，当茉莉酸甲酯浓度在10～90μmol/L时， 随着茉莉酸甲酯浓度的增加，IPS和EPS产量也随之增加。在浓度为90μmol/L时，IPS和EPS的产量均达到最大。再以90μmol/L为中心，确定茉莉酸甲酯促进安络小皮伞多糖产量的最适浓度，其结果图2(b)所示。由图2(b)可知，在茉莉酸甲酯浓度为90μmol/L时，多糖产量先增后降，在90μmol/L时达到峰值，IPS和EPS产量均达到最大。即此浓度为茉莉酸甲酯对安络小皮伞产IPS和EPS的最佳促进浓度。此时IPS产量为159.88mg/g，较对照组增长了48.24%； EPS产量为465.25mg/100mL，较对照组增长了44.19%。

图2 不同浓度茉莉酸甲酯下胞内外多糖产量

2.3 水杨酸和茉莉酸甲酯对安络小皮伞菌生长的影响

图3 水杨酸和茉莉酸甲酯处理下不同发酵时间 的安络小皮伞菌生物量

将加入800μmol/L水杨酸和90μmol/L茉莉酸甲酯的菌悬液分别作为处理组与对照组一起在恒温摇床中培养14d，每隔2d测1次生物量，结果如图3所示。由图3可知，在安络小皮伞的缓慢生长期(1～4d)内，2个处理组与对照组相比，动力学趋势基本一致。缓慢生长期基本上不发生变化。快速生长期(4～12d)时，菌体的动力学曲线斜率明显增大，单位时间内菌体指标变化加快，物质积累增长率变大。其中水杨酸对安络小皮伞的生长量影响明显，从第4天起，2个处理组的菌体开始快速增长，第8天后，水杨酸处理组的生长量明显高于对照组。第12天达到峰值。可见水杨酸提高多糖的产量与其促进菌种生长有关。整个培养期，茉莉酸甲酯对菌体的生长量没有明显影响，其处理组与对照组没有差异。说明茉莉酸甲酯促进多糖产量不是通过促进安络小皮伞的生长，而是以调节相关的代谢过程促进多糖的生成。

3 结论

研究结果表明，水杨酸和茉莉酸甲酯都可使安络小皮伞菌胞内外的多糖产量明显提高；水杨酸可促进安络小皮伞菌生物量增加，茉莉酸甲酯对安络小皮伞菌生物量没有影响，该结果为水杨酸和茉莉酸甲酯应用于液态发酵提高真菌多糖产量提供了科学依据。