山楂叶与三七叶有效部位组合物对兔全脑缺血再灌注损伤的保护作用

温富春 纪凤兰 刘博 王鑫 丁涛 宋俐霏 徐惠波

(1吉林省中医药科学院，吉林 长春 130021；2吉林大学化学院)

山楂叶提取物为蔷薇科植物山里红的干燥叶经提取、富集、精制等过程加工制成的总黄酮提取物；三七叶提取物为五加科植物的干燥茎叶经提取、富集、分离等过程加工制成的总皂苷提取物。山楂叶与三七叶有效部位(SS)组合物中主要成分为山楂叶总黄酮和三七叶总皂苷，具有活血祛瘀、通脉活络之功效,用于缺血性脑卒中恢复期的治疗〔1〕。本文观察SS组合物对家兔全脑缺血再灌注损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1药物与试剂 SS组合物，吉林省中医药科学院新药中心剂型室提供，批号20140601；血塞通胶囊，云南维和药业股份有限公司生产，批号：150347。超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒，批号：20150411；丙二醛(MDA)测定试剂盒，批号：20150202；谷氨酸测定试剂盒，批号：20150401；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)测定试剂盒，批号：20150402；均购自南京建成生物工程研究所。戊巴比妥钠，批号：84-06-12，上海化学试剂分装厂分装；肝素钠，批号：110908，中国惠世生化试剂有限公司。上海。

1.2动物 家兔，体重2.5～3.0 kg，雌雄各半，购自长春生物制品研究所有限责任公司，许可证号：SCXK(吉)-2013-0002。

1.3仪器 PowerLab/8s多导生理仪,澳大利亚Adinstruments生产；GF-D800半自动生化分析仪，山东高密彩虹分析仪器有限公司生产；UV-5100型紫外-可见分光光度计，上海精密仪器仪表有限公司生产；BX51型光学显微镜，日本Olypus公司生产；RM2245型石蜡切片机、HI1210型组织烘片机、HI1220型组织摊片机、EG1150H型组织包埋机，均为德国Leica公司生产；101A-2E型电热鼓风干燥箱，上海实验仪器有限公司生产；DHP-9082型电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司生产。

1.4实验方法〔2～4〕取家兔40只适应环境3 d后分为假手术组、模型组、血塞通(21.00 mg/kg)组,SS组合物高、低剂量组(6.370、3.185 mg/kg)，每组8只，灌胃给药7 d,末次给药1 h后，用3%戊巴比妥钠麻醉后剃净头、颈部及四肢的毛。将兔仰位固定，于喉头下缘与第一肋上缘之间沿颈腹正中线做切口，分离气管，插管以保持呼吸通畅；分别分离左右颈内、颈外动脉，穿线备用；再于双侧锁骨下缘分离皮下组织，寻找椎动脉，穿线备用；分离左侧股动脉，插管，连接血压探头测血压，分离右侧股动脉，插抗凝管备用。待各项指标稳定后，记录正常血压值之后用动脉夹夹闭双侧颈外、颈内动脉、结扎双侧椎动脉，使六动脉同时结扎，造成兔全脑缺血(假手术组不阻断血供)，同时于右侧股动脉缓慢抽血并抗凝，直至平均血压降为40 mmHg。持续缺血30 min时取下颈外、颈内动脉上的动脉夹使之再灌注，同时于耳缘静脉回输自体抗凝血。在再灌注2 h时于耳缘静脉取血后将动物实行安乐死，立即取脑，横断面取5 mm厚切片，于10%甲苯溶液固定，石蜡包埋，切片，HE染色，于光学显微镜下观察其病理学改变。剩余的脑组织于-80℃冰箱中保存备用。测再灌注2 h血清GSH-PX活力及脑组织SOD活性和MDA、谷氨酸含量。

1.5实验方法 取兔血清按试剂盒方法测定再灌2 h血清中GSH-PX活力，取脑组织0.1 g,用冰生理盐水制成10%的脑组织匀浆,4℃离心(3 000 r/min)15 min,取上清，按试剂盒方法测定SOD活性、MDA含量。取兔脑匀浆按试剂盒方法测定脑组织中谷氨酸的含量。

1.6统计学方法 采用SPSS17.0软件行方差分析。

2 结 果

2.1SS组合物对兔脑缺血30 min再灌2 h血清GSH-PX酶活力的影响 假手术组GSH-Px酶活力为(504.1±79.94)μmol/L，模型组GSH-PX酶活力为(478.1±76.59)，SS组合物高、低剂量组GSH-PX酶活力分别是(612.3±123.60)μmol/L；(637.0±148.68)μmol/L，与模型组比较均能明显增加血清GSH-PX酶活力(均P<0.05)；血塞通组GSH-PX酶活力为(627.4±135.33)μmol/L，亦能增加GSH-PX酶活力(P<0.05)。

2.2SS组合物对兔脑缺血30 min再灌2 h脑组织SOD、MDA的影响 模型组脑组织中SOD活性明显低于假手术组，MDA含量明显高于假手术组。与模型组比较,SS组合物高、低两个剂量组均能明显增加家兔脑组织中SOD活性(P<0.01；P<0.05)、降低MDA含量(P<0.01),血塞通组亦能降低脑组织中MDA含量(P<0.05)。见表1。

表1 SS组合物对兔全脑缺血30 min再灌2 h脑组织中SOD、MDA的影响

与模型组比较：1)P<0.05，2)P<0.01

2.3SS组合物对兔全脑缺血30 min再灌2 h脑组织中谷氨酸含量的影响 模型组家兔脑组织中谷氨酸含量(183.95±19.427)μmol/gprot明显高于假手术组(145.64±20.273)μmol/gprot(P<0.01)，与模型组比较SS组合物高、低剂量组均能明显降低脑组织中谷氨酸含量〔(154.86±17.742)μmol/gprot；(162.58±13.831)μmol/gprot〕(P<0.01,P<0.05)。

2.4脑组织病理学(HE染色)检查结果 光镜下，假手术组：神经细胞结构完整，血管内皮细胞及血管周围未见异常；模型组：大面积神经细胞水肿疏松、空泡化，固缩，血管内皮细胞肿胀，毛细血管内有微血栓形成，脑组织内可见梗死灶；血塞通组：大脑中度缺血改变缺血范围小，固缩神经元较少，毛细血管微血栓、梗死灶面积小于模型组；SS组合物高剂量组：大脑轻-中度缺血改变，较模型组轻、范围小，脑梗死灶面积明显比模型组小；SS组合物低剂量组：大脑轻-中度缺血改变，较模型组轻、范围小，脑梗死灶面积明显小于模型组，见图1。

图1 各组家兔脑组织病理学观察(HE，×400)

3 讨 论

脑组织缺血后再灌注时，灌注使氧大量增加可能产生大量的对脑组织有害的活性氧和自由基，进一步加重脑组织的损伤。自由基水平升高、细胞内的钙离子超载、兴奋性氨基酸过度释放，造成细胞膜脂质氧化，细胞凋亡，脑神经受到不可逆损伤〔5〕。SOD是人体的氧自由基清除酶,能够清除机体超氧阴离子自由基，直接阻断脂质过氧化链式反应，保护组织免受自由基损伤，测定SOD活性可反映机体抗氧化能力的变化〔6〕。MDA是生物体内脂质发生过氧化反应的代谢产物，测量MDA含量，可反映机体内氧自由基水平〔7〕。GSH-PX 的主要作用是清除脂类过氧化物和过氧化氢(H2O2)，保护生物膜及生物大分子免受自由基的损害。抗氧化应激作用是中药发挥治疗脑梗死药效的重要途径〔8〕。本研究中观察到，家兔全脑缺血再灌注后兔脑组织中SOD活性明显降低、MDA含有量显著升高，说明再灌注后所产生的大量氧自由基使SOD 活性降低，从而加大细胞受损程度，使得MDA含有量升高。SS组合物高、低剂量能够明显增加兔脑组织中SOD的活性及血清中GSH-PX酶活力，减少脂质过氧化物MDA的生成，说明了SS组合物可拮抗自由基损害，有利于神经细胞的修复。健康的脑细胞中兴奋性和抑制性神经递质间保持着动态平衡。缺血缺氧能够打破这种平衡，内源性兴奋性递质谷氨酸会迅速增加，进而导致神经细胞损伤〔9〕。谷氨酸可通过激活N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDA)受体产生兴奋性毒性作用。脑缺血后NMDA受体被激活,导致兴奋性氨基酸过度释放,是缺血性脑损害的关键因素之一。因此,抑制兴奋性氨基酸的释放和拮抗其毒性是治疗脑缺血再灌注损伤的关键之一〔10〕。本研究观察到SS组合物高、低剂量组能明显地减少家兔脑组织中的谷氨酸含量,从而可以减轻兴奋性氨基酸的损伤。病理学检查结果提示，SS组合物对家兔全脑缺血再灌注损伤具有保护作用。综上，SS组合物对家兔全脑缺血再灌注损伤具有一定的保护作用，其机制可能与抗氧化和抑制兴奋性氨基酸释放或拮抗兴奋氨基酸毒性有关。