水飞蓟素对急性胰腺炎大鼠急性肺损伤及MAPK/NF-κB信号通路的影响

陈彩云，许秋霞，张 吟，庄奕筠，高雅莉

(福建医科大学附属第二医院药学部，福建 泉州 362000)

急性胰腺炎属于临床常见腹部急性病症，轻度易于治疗，重型急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)不但引发胰腺重度炎症、组织坏死，还会影响全身重要器官功能，其中肺部为最易受累的器官。调查显示，SAP中肺损伤发生率高达70%，是导致SAP患者死亡的重要原因[1]，因此，探究其发病机制，对于预防及治疗SAP肺损伤者，改善预后，均十分重要。近期研究显示，核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)的激活可导致肺损伤的发生，而抑制其表达后，可减轻肺损伤[2]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)家族成员主要包括p38、ERK、JNK，参与机体多种炎症反应。研究显示，在肺损伤过程中，激活MAPK通路后，可释放大量炎症因子，加重病情[3]。以上研究表明，MAPK/NF-κB可能作为SAP肺损伤的靶点。

水飞蓟素(silymarin)是从水飞蓟种皮中提取的黄铜木质素化合物。临床研究显示，水飞蓟素不仅可用于肝病预防、治疗，且具有广泛的抗肿瘤作用，如在前列腺癌、肝癌、宫颈癌、乳腺癌中，能够抑制癌细胞增殖分化[4]。张珂等[5]研究显示，水飞蓟素可通过抑制炎症反应及氧化应激损伤，减轻大鼠肺缺血/再灌注损伤。以上研究表明，水飞蓟素对肺损伤具有一定的保护作用，但有关水飞蓟素在SAP引发的肺损伤的作用机制目前研究不多。为此，本研究通过建立SAP大鼠模型，观察水飞蓟素处理对MAPK/NF-κB信号通路的影响，探究其潜在作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物SPF级♂SD大鼠72只，8周龄，体质量230～260 g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号为2015000504404。所有大鼠均在昼夜交替、自然光照下饲养，饲养过程中维持恒温25 ℃，湿度为50%，期间大鼠自由饮水、摄食，定时对鼠笼进行清理，饲养期间所需水、食物及其他用品等，均经消毒，维持饲养环境清洁，保持通风。

1.2试剂与仪器水飞蓟素购于上海纯优生物科技有限公司，批号：20160803；地塞米松注射液，广西万德药业股份有限公司，批号：20161107；苏木精、伊红染液购自美国Sigma公司；BCA蛋白检测试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司；TNF-α、IL-1β ELISA试剂盒(批号：20161204、20160918)，购于美国R&D公司；兔抗鼠p65、p-p65、IκBα、p-IκBα、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK抗体，购自美国Santa Cruz公司；兔抗鼠p38、p-p38、辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG二抗，购自美国R&D公司。蛋白凝胶成像仪，购自Bio-Rad公司；全自动血气分析检测仪，购于美国Beckman公司。

1.3方法

1.3.1动物模型的制备 根据文献方法[6]，制备SAP大鼠模型，制备前大鼠自由饮水，禁食12 h，腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉，随后固定于手术台，常规消毒、铺巾后，于腹部正中部位做一切口，暴露十二指肠，并将其提出体外，识别胰胆管汇入十二指肠系膜乳头开口处，在其下缘肠壁处选取无血管区，用注射器针头穿刺后，将5 cm硬膜外导管(外径0.61 mm PE10聚乙烯导管)置入，朝向开口方向缓慢推进5 cm后，缝扎胰胆管下段及硬膜外导管，于导管末端连接输液转换器，泵入5%牛黄胆酸钠1 mL·kg-1，流速控制在0.2 mL·min-1，2 min后，见胰胆管以及主胰管扩张后，维持10 min，将缝扎线去除，并将导管退出，封闭穿刺孔，复位十二指肠后逐层关腹。

1.3.2动物分组 将大鼠分为假手术组(仅翻动十二指肠、胰腺，不穿刺注药)、模型组、水飞蓟素低、中、高剂量组、地塞米松组(阳性组)。SAP模型制备完成后，水飞蓟素低、中、高剂量组即刻腹腔注射用DMSO配制成的混悬液50、100、200 mg·kg-1，地塞米松组注射2 mg·kg-1地塞米松；假手术组、模型组腹腔注射同量生理盐水，共给药3 d。

1.3.3标本采集 各组随机选取6只大鼠，末次给药后，即刻采集下腔静脉血3 mL，随后剖腹采集腹主动脉血，将大鼠处死后获得胰腺组织、肺组织。

1.3.4动脉血气指标测定 采用全自动血气分析检测仪器，检测腹主动脉血中氧分压(arterial partial pressure of oxygen，PaO2)、二氧化碳分压(arterial partial pressure of carbon dioxide，PaCO2)，计算氧合指数(oxygenation index，OI)。

1.3.5血清中淀粉酶、TNF-α、IL-1β水平的检测 下腔静脉血凝固后离心，保留上清液，采用碘比色法检测血清淀粉酶含量；采用ELISA法检测TNF-α、IL-1β水平，具体参照试剂盒说明书进行操作。

1.3.6大鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage，BAL)中中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophils，PMN)计数 各组选取6只大鼠进行支气管肺泡灌洗，利用自动血细胞分析仪对BAL中PMN进行计数。

1.3.7肺组织湿干重(wet weight/dry weight，W/D)测定 切除肺组织右肺下叶，用滤纸擦干后，置于玻璃试管中称重，此时为肺组织湿重(W)，置于烤箱中，温度设定为60 ℃，连续烘烤、称重，直至肺组织重量不再变化，此时所测重量为干重(D)。

1.3.8光镜下观察病理学变化 制备胰腺、肺组织石蜡切片，进行HE染色，采用Schmidt病理评分法[7]，从胰腺水肿、坏死、炎症细胞浸润等方面对染色结果进行评定，分为5个等级，以0、1、2、3、4分进行标记。采用Holfbauer评分法[8]，对水肿、出血、炎症浸润等进行评定：肺部无病变为0分；25%视野出现以上病变为1分，50%视野出现病变为2分；75%视野存在以上病变为3分；整个视野均出现以上病变为4分。

1.3.9Western blot检测 肺组织剪碎后，添加蛋白裂解液放置30 min，离心后收集上清液，蛋白提取试剂盒提取细胞中蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，随后进行SDS-PAGE电泳。电泳后，将蛋白转移至PVDF膜，添加脱脂牛奶封闭后洗膜，添加1 ∶300稀释的兔抗鼠p65、p-p65、IκBα、p-IκBα、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、p38、p-p38 一抗，置于4 ℃过夜，清洗后加二抗，置于37 ℃中孵育2 h，ECL显色后，凝胶成像仪中观察蛋白表达，并保存图像。

2 结果

2.1动脉血气指标测定结果Tab 1结果显示，与假手术组相比，模型组PaCO2升高，PaO2、OI降低，差异有显著性(P<0.05)。与模型组相比，水飞蓟素低、中、高剂量组和阳性组PaCO2降低，PaO2、OI升高，具有剂量依赖性，差异有显著性(P<0.05)。

Tab 1 Comparison of PaCO2, PaO2 and OI levels in each group of rats n=6)

*P<0.05vssham;#P<0.05vsmodel

2.2血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β测定结果Tab 2结果显示，与假手术组相比，模型组淀粉酶活性、TNF-α、IL-1β水平升高，差异有显著性(P<0.05)。与模型组相比，水飞蓟素低、中、高剂量组和阳性组淀粉酶活性、TNF-α、IL-1β水平降低，具有剂量依赖性，差异有显著性(P<0.05)。

Tab 2 Comparison of amylase, TNF-α and IL-1β levels in each group of rats n=6)

*P<0.05vssham;#P<0.05vsmodel

2.3各组大鼠W/D、PMN对比Tab 3结果显示，与假手术组相比，模型组胰腺、肺组织W/D、PMN升高，差异有显著性(P<0.05)。与模型组相比，水飞蓟素低、中、高剂量组和阳性组胰腺、肺组织W/D、PMN降低，具有剂量依赖性，差异有显著性(P<0.05)。

Tab 3 Comparison of W/D, PMN levels in each group of rats n=6)

*P<0.05vssham;#P<0.05vsmodel

2.4胰腺、肺组织病理形态学观察Fig 1的HE染色显示，假手术组大鼠胰腺组织细胞正常，胰腺小叶完整，间质未出现炎性细胞浸润、充血以及坏死组织。模型组胰腺腺泡细胞出现大量坏死，结构模糊、融合成一片，小叶结构模糊，出现大量炎症细胞浸润，肺泡间间隔明显变宽。水飞蓟素组及阳性组均得到明显改善，且随着处理剂量的增加，肺组织逐渐恢复正常。Tab 4结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠胰腺组织病理评分升高，差异有显著性(P<0.05)；与模型组相比，阳性组、水飞蓟素组胰腺组织病理评分均降低，随着给药剂量的升高，肺组织病理评分逐渐降低，差异有显著性(P<0.05)。

如Fig 2所示，假手术组肺泡结构完整，肺间质未出现水肿、充血、炎性细胞浸润等。模型组肺泡壁变厚、间隔变宽，肺间质出现充血，且伴随大量炎性细胞浸润。水飞蓟素组及阳性组均得到明显改善，且随着处理剂量的增加，肺组织逐渐恢复正常。Tab 4结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠肺组织病理评分升高，差异有显著性(P<0.05)；与模型组相比，水飞蓟素组及阳性组大鼠肺组织病理评分均降低，随着给药剂量的升高，肺组织病理评分逐渐降低，差异有显著性(P<0.05)。

Fig 1 Pathological staining structure of pancreatic tissues (×100)

A: Sham operation group; B: Model group; C: Silymarin low dose group; D: Silymarin medium dose group; E: Silymarin high dose group; F: Dexamethasone group.

Fig 2 Pathological staining of lung tissues (×200)

A: Sham operation group; B: Model group; C: Silymarin low dose group; D: Silymarin medium dose group; E: Silymarin high dose group; F: Dexamethasone group.

Tab 4 Comparison of pathological scores of pancreas tissues and lung tissues in rats n=6)

*P<0.05vssham;#P<0.05vsmodel

2.5大鼠肺组织MAPK信号通路蛋白检测如Fig 3、Tab 5所示，与假手术组相比，模型组p-JNK、p-p38、p-ERK1/2蛋白表达升高(P<0.05)。与模型组相比，水飞蓟素低、中、高剂量组和阳性组p-JNK、p-p38、p-ERK1/2蛋白表达降低，具有剂量依赖性(P<0.05)。各组间JNK、p38、ERK1/2蛋白表达无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)。

Fig 3 Protein expression of MAPK signaling pathway

1: Sham operation group; 2: Model group; 3: Silymarin low dose group; 4: Silymarin medium dose group; 5: Silymarin high dose group; 6: Dexamethasone group.

2.6大鼠肺组织NF-κB通路蛋白检测如Fig 4、Tab 6所示，与假手术组相比，模型组p-p65、p-IκBα蛋白表达升高(P<0.05)。与模型组相比，水飞蓟素低、中、高剂量组和阳性组p-IκBα蛋白表达降低，具有剂量依赖性(P<0.05)。各组间p65、IκBα蛋白表达无明显变化(P>0.05)。

Fig 4 Protein expression of NF-κB pathway

1: Sham operation group; 2: Model group; 3: Silymarin low dose group; 4: Silymarin medium dose group; 5: Silymarin high dose group; 6: Dexamethasone group.

3 讨论

SAP损伤后，病理学主要表现有小叶局部坏死，胰腺细胞中出现大量炎症细胞浸润，胰腺腺泡破坏等病理特征。本研究HE 染色显示，模型组大鼠胰腺组织腺泡细胞出现大量坏死，结构模糊、融合成一片，小叶结构模糊，出现大量炎症细胞浸润，肺泡间间隔明显变宽，这与临床上水肿型胰腺炎病理特征相似[9]，提示SAP模型大鼠制备成功。而给予水飞蓟素处理后，胰腺组织腺泡细胞破裂减少，随着处理剂量的增加，炎症浸润也明显减轻，以上均提示水飞蓟素可减轻SAP胰腺炎症。肺组织损伤具有典型病理特征，如肺泡结构变化、肺水肿及炎性浸润。本研究进一步对肺组织进行HE染色，结果显示模型组肺泡壁变厚、间隔变宽，肺间质出现充血，且伴随大量炎性细胞浸润，表明SAP可导致大鼠肺组织损伤，而给予水飞蓟素处理后，肺组织损伤程度明显减轻。研究证实，地塞米松对脂多糖诱导的急性肺损伤具有保护作用[10]。本研究以地塞米松作为阳性对照药物，结果显示，水飞蓟素高剂量组大鼠肺组织恢复程度与阳性组相似，提示水飞蓟素可缓解SAP所引发的肺损伤，与地塞米松处理结果相似。

Tab 5 Expression of JNK, p-JNK, p38, p-p38, ERK1/2, p-ERK1/2 protein in lung tissues of rats n=6)

*P<0.05vssham;#P<0.05vsmodel

Tab 6 p65, p-p65, IκBα and p-IκBα pathway proteins in rat lung tissues n=6)

*P<0.05vssham;#P<0.05vsmodel

肺泡巨噬细胞可产生大量TNF-α、IL-1β等促炎性细胞因子，引起炎症反应。动物研究发现，IL-1β抗体可减轻急性肺损伤动物模型中的肺损伤[11]。此外，研究发现，IL-1β、TNF-α等细胞因子表达的上调，能够进一步促进中性粒细胞浸润至损伤肺组织中，加重肺组织炎症反应，形成恶性循环[12]。以上表明，中性粒细胞浸润、炎性细胞因子是与肺炎症性损伤有关的关键因素。本研究发现，大鼠血清TNF-α、IL-1β、PMN明显升高，进一步证实SAP大鼠肺组织炎性损伤。水飞蓟素可通过降低机体炎症反应，缓解SAP大鼠肺损伤，与地塞米松处理结果相似，提示水飞蓟素可能通过减少血清中炎症细胞因子，抑制肺组织中性粒细胞浸润，从而减轻肺组织炎症反应，缓解肺组织损伤。

NF-κB/MAPK信号通路过度激活，在肺损伤的发生中发挥重要作用。NF-κB一般情况下被IκB抑制，以非活性状态存在细胞质中，在外界刺激下IκB发生磷酸化被激活后，NF-κB抑制作用被解除，磷酸化后进入细胞核内，促进靶基因的转录。本研究结果显示，模型组大鼠p-p65、p-IκBα蛋白表达升高，说明NF-κB通路被激活。国内学者在肺损伤动物研究中也发现，模型组大鼠NF-κB信号通路相关蛋白表达明显高于正常组大鼠，与本研究结果一致[13]。在给予水飞蓟素后，p-IκBα蛋白表达明显降低，与地塞米松处理结果相似，表明水飞蓟素可能通过抑制NF-κB信号通路活性，缓解肺部炎症损伤。

MAPK信号通路激活后，可促进机体内大量炎症因子的释放，进而加重炎症反应[14]。本研究结果显示，模型组p-JNK、p-p38、p-ERK1/2蛋白表达较假手术组明显升高，与以往报道相符[15]，提示SAP大鼠可能通过激活MAPK信号通路，导致肺损伤。进一步研究显示，在给予水飞蓟素后，肺组织中p-JNK、p-p38、p-ERK1/2蛋白表达较模型组明显降低，与地塞米松处理结果相似，说明水飞蓟素可抑制SAP引发的MAPK信号通路激活，进而缓解肺部损伤，保护肺组织。

综上所述，水飞蓟素能够降低SAP大鼠肺部炎症反应，同时抑制NF-κB/MAPK信号通路活性，推测水飞蓟素改善SAP肺损伤可能与抑制NF-κB/MAPK信号通路有关。SAP肺损伤机制较复杂，本研究中水飞蓟素仅能部分缓解肺组织炎症反应，而非逆转SAP引发的大鼠肺损伤，可能与其他因素有关，还有待深入探究，以期为疾病的治疗提供更有力的实验依据。