滇结香花中5种化学成分对四氯化碳肝损伤小鼠的保护作用

南彩云，钟国跃，朱继孝，杨 雯，李辉虎，张风波，张博文，李 敏

(江西中医药大学中药资源与民族药研究中心，江西 南昌 330004)

滇结香花为瑞香科结香属植物滇结香[Edgeworthiagardneri(Wall.) Meisn.]的干燥花蕾，民间常用于青盲、翳障、多泪、羞明等眼部疾患[1]。课题组的前期研究表明，滇结香主要含有黄酮类、香豆素类、有机酸类等化合物，其60%乙醇提取部位具有良好的抗四氯化碳(CCl4)诱导的小鼠肝损伤作用[2]，并从中分离得到了12个成分。研究发现[3-4]，西瑞香素具有较好的抗肿瘤作用，对二甲苯引起的小鼠耳廓肿胀及鸡蛋清引起的大鼠足跖肿胀有较好的抑制作用。Nurgun等[5]研究表明，银锻苷对卡拉胶诱导的脚掌水肿，具有较强的抑制作用。Yan等[6]发现，结香苷C对于冰醋酸法致痛觉模型具有较强的镇痛作用，但均未有关于肝保护作用方面的研究。本研究对分离得到的5种宏量化合物西瑞香素、水杨酸、结香苷C、银锻苷、紫云英苷进行了小鼠体内实验，以探讨滇结香保肝活性成分物质及其可能的作用机制。

1 材料

1.1药品与试剂联苯双酯滴丸，购自浙江万邦药业股份有限公司，批号：A02151219；西瑞香素、水杨酸标准品，购自南京道斯夫生物科技有限公司；紫云英苷标准品，购自成都德斯特生物技术有限公司；结香苷C、银锻苷均为实验室自制，纯度达98%；谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT，批号：20170614)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST，批号：20170614)、丙二醛(malondialdehyde，MDA，批号：20170607)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，批号：20170612)测定试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；动物组织总RNA提取试剂盒、D2000 DNA Marker(天根生化科技有限公司)；反转录试剂盒(批号：0000228426)、GelRedTM1000×in water(Promega公司)；Tap PCR Green Mix(北京鼎国生化有限公司)；TNF-α、IL-6、GAPDH引物，均由北京鼎国生化有限公司合成。

1.2仪器高速冷冻离心机(美国Beckman-Coulter公司)；Multiskan GO全波长酶标仪(美国Thermo公司)；紫外分光光度计UV-1800(日本岛津有限公司)；DY89-II电动匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)；TKY-BMB型石蜡包埋机、包埋专用冷台(湖北省泰康医疗设备有限公司)；半自动轮转式切片机 RM2245(北京长恒荣创科技有限公司)；XI15正置显微镜(日本奥林巴斯有限公司)。

1.3实验动物130只昆明种成年♂小鼠，SPF级，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2016-0002。实验室温度(24±2)℃，相对湿度(50±2)%。

2 方法

2.1小鼠分组及给药130只小鼠(20～30 g)随机分成13组，每组10只。分别为空白对照组、模型组、联苯双酯组(阳性对照组)、紫云英苷低、高剂量组(ZL、ZH)，西瑞香素低、高剂量组(XL、XH)，结香苷C低、高剂量组(JL、JH)，水杨酸低、高剂量组(SL、SH)，银锻苷低、高剂量组(YL、YH)。参考文献[7]并结合预实验，确定各个给药组低、高剂量组给药剂量为50、100 mg·kg-1，联苯双酯组的剂量为150 mg·kg-1。各个药物分别混悬于0.5%的羧甲基纤维素钠溶液中，连续给药7 d，空白对照组和模型组给予相应体积的生理盐水。

2.2模型建立以CCl4诱导小鼠急性肝损伤模型。d 6给药1 h后，腹腔注射0.2% CCl4花生油溶液10 mL·kg-1。空白对照组给予相应体积的花生油。造模后，禁食不禁水，16 h后给药1次，1 h后眼眶取血，全血5 000 r·min-1、4 ℃离心10 min，取血清置于4 ℃冰箱备用。小鼠断颈脱臼处死，并于冰台快速分离相同部位肝脏组织2份，其中一份10%甲醛固定，另一份取出后置于-70 ℃冰箱备用[8]。

2.3生化指标的测定将离心后的血清取出，用酶标仪按试剂盒测定ALT、AST等指标。取左叶肝脏组织0.1 g，以生理盐水为溶剂，制备成10%的肝组织匀浆，3 000 r·min-1离心10 min，取上清液，采用测试盒比色皿法，分别测定SOD、MDA的含量。

2.4肝组织病理学检测取10%甲醛固定好的肝脏大叶，常规石蜡包埋、切片、HE染色，并于光镜下观察拍照。

2.5肝组织TNF-α、IL-6mRNA表达的检测每组取15 mg左右肝组织样品，共13组，按照RNA动物组织提取试剂盒说明书提取肝组织总RNA，1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA纯度。取4 μL总RNA，进行反转录，合成cDNA。所用引物序列信息[9-11]见Tab 1。PCR反应体系总体积为50 μL，GAPDH基因PCR扩增条件为94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环28次，72 ℃终止10 min；TNF-α基因PCR扩增条件为94 ℃预变性3 min，94 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循环34次，72 ℃终止10 min；IL-6基因PCR扩增条件为94 ℃预变性3 min，94 ℃变性45 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环35次，72 ℃终止7 min。PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳及Biotium GelRed染液染色，凝胶影像分析仪分析，以GAPDH为内参对照，目的mRNA与GAPDH的RT-PCR产物的吸光度值比值作为目的mRNA相对表达量。

3 结果

3.1对CCl4肝损伤小鼠肝匀浆SOD、MDA活性及血清ALT、AST水平的影响Tab 2结果显示，与空白对照组相比，小鼠肝组织匀浆中SOD含量明显降低，MDA含量明显上升，小鼠血清中ALT、AST水平明显增高，差异均有统计学意义(P<0.01)，表明造模成功。与模型组相比较，各给药组小鼠肝组织匀浆中SOD含量明显升高，MDA含量明显降低(P<0.01，P<0.05)；纵向比较血清中生化指标，ZH、SH、JL、JH、XH、YH各给药组ALT水平均有明显降低，差异具有显著性(P<0.01，P<0.05)，ZL、SL、XL、YL给药组ALT水平虽有所降低，但差异无显著性(P>0.05)，ZH、SH、JL、JH、XL、XH、YH各给药组的AST含量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.01，P<0.05)，ZL、SL、YL给药组AST含量虽有所降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。

3.2肝脏组织病理学变化如Fig 1所示，正常组肝小叶结构完整，肝细胞形态正常，肝细胞索排列整齐，细胞连接紧密；模型组肝细胞水肿，肝细胞弥漫性变性，肝窦变窄，有大量的炎性细胞浸润，甚至出现细胞坏死；阳性对照组肝细胞与模型组相比较，细胞状况明显改善，少量炎性细胞浸润；ZH、SH、JL、JH、XH、YH各给药组肝细胞结构有明显改善,肝细胞脂肪变性明显减轻,炎性细胞浸润、坏死程度明显减轻，受损面积明显变小；ZL、SL、XL、YL给药组肝细胞肝索排列紊乱，肝小叶可见大量肝细胞坏死,细胞膜溶解消失或碎裂，细胞核有明显聚集现象，与模型组对比，无明显改善。

Tab 1 Information of PCR primers

Tab 2 Effects of different compounds on activity of SOD, MDA and levels of serum ALT, AST on carbon tetrachloride-induced liver injury in

*P<0.05,**P<0.01vsnormal;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

Fig 1 Effects of different compounds on carbon tetrachloride-induced liver injury tissue in mice(HE, ×200)

3.3对肝组织TNF-α、IL-6mRNA表达的影响如Fig 2所示，CCl4引起的小鼠急性肝损伤使TNF-α、IL-6 mRNA的表达明显增加，亦能表明实验造模成功。各不同单体化合物及不同给药剂量组对TNF-α、IL-6 mRNA的表达结果显示： 除ZL给药组外，其他给药组均可明显抑制TNF-α mRNA的表达，而且JL、JH、ZH组的抑制作用与阳性对照组作用相当；不同给药组中，除YL、ZL、XL组外，其他给药组均可明显抑制IL-6 mRNA表达，且JL、JH、ZH、XH给药组与阳性对照组比较，差异无显著性。

4 讨论

CCl4是经典的诱导肝损伤动物模型的化学物质，该动物模型具有指标明确、重复性好等优点。其诱导机制主要为当肝脏受到损伤时，肝细胞内酶大量释放到血液，导致血内ALT、AST等酶含量明显升高，故血清中ALT、AST的含量高低可在一定程度上反映出肝细胞损伤程度。CCl4进入体内经肝微粒体细胞色素P450代谢，可引起脂质过氧化作用，并形成脂质过氧化物MDA，SOD作为机体内天然存在的超氧自由基清除因子之一，可有效清除由CCl4作用产生的自由基，MDA、SOD的含量高低可反映肝细胞的修复程度[12]。本研究采用小鼠CCl4肝损伤经典模型，试剂盒测定血清中ALT、AST含量及肝匀浆中MDA、SOD的含量，对5种成分进行了保肝活性评价。结果表明，与模型组比较，ZH、SH、JL、JH、XH组血清中ALT、AST水平明显降低，结合各个给药组病理切片，说明该5组给药组能增强肝细胞抗损伤能力，增加膜结构的稳定性，对肝脏有一定的保护作用。肝组织中MDA含量降低，SOD含量升高，提示该5组实验组具有增强肝脏抗氧化能力、减少脂质过氧化物生成的作用。其中，结香苷C(JL、JH)给药组与阳性对照组实验效果相近，作用最佳，可能为滇结香保肝作用的主要有效成分之一。

Fig 2 Effect of different compounds on expressions of TNF-α, IL-6 mRNA in mouse

1:Normal; 2: Model; 3: Positive; 4: YL; 5: YH; 6: ZL; 7: ZH; 8: SL; 9: SH; 10: JL; 11: JH; 12: XL; 13: XH.**P<0.01vsnormal;#P<0.05,##P<0.01vsmodel.

本研究从分子水平对5种成分的保肝活性及其作用机制进行了探讨。观察TNF-α、IL-6 mRNA的表达水平，探究各成分的肝保护作用及其可能的作用机制。TNF-α是一种主要由单核巨噬细胞分泌的具有多种生物活性的多肽调节因子。CCl4可激活枯否氏细胞产生TNF-α等促炎细胞因子，这些炎性介质的释放可活化中性粒细胞，通过自分泌或旁分泌作用，激活免疫细胞和炎性反应信号通道[13]，诱导其他炎性因子如IL-6 mRNA的表达，进一步产生氧自由基，加重炎性反应[14]。IL-6是白介素家族的成员，由巨噬细胞、单核细胞及淋巴细胞等炎症细胞产生的促炎症细胞因子[15]，可使T、B细胞及NK细胞广泛激活，诱导其他炎性介质的产生，从而加剧和促进局部炎症的形成。实验结果显示，CCl4能明显促进TNF-α、IL-6 mRNA的表达，结合组织病理切片及血清、血浆指标，与模型组比较，表明ZH、SH、JL、JH、XH、YH组可有效抑制TNF-α、IL-6 mRNA的表达，降低血清、血浆中TNF-α和IL-6的含量，且JL、JH、YH给药组具有下调TNF-α、IL-6 mRNA表达的作用，与阳性对照组相比较，差异无显著性，表明其可能是通过调节机体免疫功能而降低CCl4引起的肝损伤。

综上，ZH、SH、JL、JH、XH、YH给药组可降低肝匀浆中MDA的含量，提高SOD的生物活性，降低血清中ALT、AST的含量，以及抑制肝组织中TNF-α mRNA和IL-6 mRNA的表达，可能是通过调节小鼠的免疫功能，增强肝脏抗氧化能力，减少脂质过氧化物生成，从而达到缓解、降低小鼠肝损伤的效果。前期研究表明，滇结香60%乙醇提取部位对CCl4致急性肝损伤小鼠具有较好的保肝作用，其降ALT、AST作用优于阳性对照联苯双酯组[3]。本次实验中所考察的单体药物均来自于该部位，结果显示，ZH、SH、JL、JH、XH、YH给药组均具有良好的保肝作用，但降ALT、AST作用均弱于60%乙醇提取部位，提示该部位中可能还存在保肝活性更强的微量成分，或各成分之间存在协同作用，还有待进一步研究。