p44/WDR77基因与细胞周期蛋白D3在非小细胞肺癌中的表达及相关性研究*

崔渊博 张志培 景鹏宇 王雪娇 王武平 李维妙 谷仲平

肺癌是对人类健康危害最大的恶性肿瘤之一，且发病率呈逐年上升趋势[1-2]。在我国，每年约有70万人死于肺癌，其中80%以上的肺癌患者为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)[3-4]。作为原发性肺癌的主要病理类型，NSCLC对目前的放化疗方案敏感性较差，手术治疗难以达到根治效果，致使患者的5年生存率仍低于20%[5-6]。肺癌的发生机制是个复杂的过程，而细胞周期失调正是肿瘤细胞的基本特性。目前的研究表明，细胞周期蛋白D3(Cyclin D3)作为Cyclin D的亚型之一，能促进G1/S期的转换，在肿瘤细胞的生长与增殖中扮演着关键角色[7]。

雄激素受体辅助因子(44-KDa androgen receptor cofactor/WD repeat domain 77，p44/WDR77)是新发现的人类肿瘤相关基因，其同样作用于细胞周期G1期，促进细胞增殖，与前列腺癌的发生发展密切相关[8]。目前，有关p44/WDR77在NSCLC中的表达、与Cyclin D3表达的相关性以及对NSCLC发生发展的影响和作用研究较少。因此，本研究通过免疫组织化学法对NSCLC标本中p44/WDR77与Cyclin D3的表达情况进行检测，分析二者表达的相关性以及其与NSCLC临床及病理特征的关系，为NSCLC患者的诊断及防治提供有价值的检测依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集2006年3月至2011年9月第四军医大学唐都医院胸外科手术切除的190例原发性NSCLC患者的肿瘤组织配对标本，正常组织取自癌旁5 cm以上且病理检查为正常形态的肺组织。190例原发性NSCLC患者中男性145例，女性45例；年龄30～80岁，平均年龄(61±16.8)岁。所有病例均有完整的临床及病理资料，术前均未接受放化疗或生物学等抗癌治疗。配对标本经中性甲醛固定、脱水及透明，常规石蜡包埋。组织病理分型、分级由病理科诊断。本研究所用标本的使用均征得了第四军医大学唐都医院医学伦理委员会的同意，且患者本人或家属知情。

1.2 检测试剂

p44/WDR77抗体为兔抗人多克隆抗体(Gu等[9]预先纯化、克隆而成)；Cyclin D3蛋白抗体为Cell Signaling商品化鼠源性抗体(购自丹麦DAKO产品)；EnVisionTM免疫组织化学试剂盒购自丹麦DAKO产品；DAB显色剂购自北京中杉金桥公司。

1.3 操作步骤

标本经4 µm连续切片，分别做HE和免疫组织化学染色。免疫组织化学染色采用两步法(EnVisionTM)。

(1)切片脱蜡至水后尿素消化，3%过氧化氢封闭，用柠檬酸缓冲液进行微波修复、冷却，10%羊血清封闭，加一抗4 ℃过夜；37 ℃复温，加入抗兔二抗(EnVisionTM)，37 ℃恒温反应，中间各步使用磷酸缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)清洗，DAB显色，显微镜观察终止显色。

(2)苏木素轻微复染，脱水透明封片，光镜下观察。对照组设阳性、阴性和空白对照：用已知阳性表达组织作为阳性对照；以PBS代替一抗作为空白对照。

1.4 结果判读

所有切片均经2位资深病理医师采用盲法阅片。按照半定量积分方法判定，每例均随机观察5个高倍视野(×400)。

判断结果：①阳性细胞≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分；②阳性强度黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将细胞阳性率与染色强度积分相乘，0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为中度阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0软件对免疫组织化学结果数据进行统计学分析，p44/WDR77、Cyclin D3在NSCLC组织和正常组织中表达的差异性用Wilcoxon(W)检验；两组间采用Mann-Whitney U秩和检验，3组以上采用Kruskal-Wallis H检验；两者表达的相互关系用Spearman秩相关检验，以r表示秩相关系数。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 p44/WDR77和Cyclin D3的定位及其在NSCLC组织与正常组织中的表达

(1)p44/WDR77和CyclinD3均定位于细胞核与细胞质中，NSCLC组织中高表达(如图1所示)。

图1 p44/WDR77和Cyclin D3在NSCLC中的表达(免疫组织学化Envision法)

(2)p44/WDR77和Cyclin D3的总阳性率分别为82.63%(157/190)和86.32%(164/190)，相应病例正常组织阳性率分别为11.05%(21/190)和5.79%(11/190)；p44/WDR77及Cyclin D3在腺癌、鳞癌中的阳性率分别为83.33%(60/72)、82.20%(97/118)、91.67%(66/72)及83.05%(98/118)，相应病例正常组织阳性率分别为9.72%(7/72)、11.86%(14/118)、2.78%(2/72)及7.63%(9/118)。p44/WDR77在NSCLC、腺癌、鳞癌组织与相应正常组织中的表达差异均有统计学意义(Z=11.379，Z=7.000，Z=9.459；P＜0.05)。Cyclin D3在NSCLC、腺癌及鳞癌组织与相应正常组织中的表达差异均有统计学意义(Z=11.386，Z=7.225，Z=8.827；P＜0.05)。

2.2 NSCLC临床特征与p44/WDR77及Cyclin D3的表达

p44/WDR77的表达与患者年龄差异有统计学意义(Z=-2.614，P＜0.05)，而与患者的性别无统计学意义(Z=-0.545，P＞0.05)；Cyclin D3的表达与患者年龄、性别差异无统计学意义(Z=-0.265，Z=-0.870；P＞0.05)，见表1。

2.3 NSCLC组织病理分型、分级间p44/WDR77及Cyclin D3的表达

p44/WDR77及Cyclin D3在腺癌与鳞癌间表达均差异无统计学意义(Z=-1.777，Z=-1.252；P＞0.05)；但在NSCLC组织不同病理分级间的表达差异均有统计学意义(x2=17.077，x2=6.233；P＜0.05)，其中腺癌、鳞癌组织不同病理分级与p44/WDR77表达相关(x2=7.051，x2=10.184；P＜0.05)，而与Cyclin D3表达均无相关性(x2=3.277，x2=5.081；P＞0.05)，见表2、表3。

2.4 NSCLC的TNM分期与p44/WDR77、Cyclin D3的表达

p44/WDR77及Cyclin D3在NSCLC不同TNM分期间的表达差异均有统计学意义(x2=11.842，x2=10.273；P＜0.05)，见表3。

表1 p44/WDR77和Cyclin D3在NSCLC不同年龄及性别中表达的差异性(例)

表2 p44/WDR77和Cyclin D3在NSCLC不同病理类型中表达的比较(例)

表3 p44/WDR77和Cyclin D3在NSCLC不同病理类型中表达的比较(例)

表4 p44/WDR77和Cyclin D3在NSCLC是否淋巴转移患者分组中表达的比较(例)

表5 p44/WDR77 和Cyclin D3在NSCLC、腺癌及鳞癌中表达的相关性(例)

2.5 NSCLC的淋巴结转移情况与p44/WDR77、Cyclin D3的表达差异性

在有淋巴结转移的患者组织中，Cyclin D3阳性表达率高于无淋巴结转移的患者，差异有统计学意义(Z=-2.103，P=0.035)；而p44/WDR77表达在淋巴结转移与否间的患者中表达差异无有统计学意义(Z=-0.488，P=0.626)，见表4。

2.6 p44/WDR77和Cyclin D3在NSCLC组织中蛋白表达相关性检验

经Spearman秩相关检验，在NSCLC、腺癌及鳞癌组织中p44/WDR77和Cyclin D3蛋白表达秩相关性在鳞癌、NSCLC组织中呈正相关(r=0.231，r=0.156，r=0.283；P＜0.05)，见表5。

3 讨论

p44/WDR77是一个与雄激素受体相互作用的蛋白，因其相对分子质量为44×103，且含有间隔77个氨基酸重复出现色氨酸和天门冬氨酸结构，故将其命名为p44/WDR77[10]。最近的研究证实，其作用于细胞周期G1期，对细胞增殖、分化过程具有促进作用，特别是在肿瘤的发生发展过程中扮演着十分重要的角色[11-13]。同样对G1期调控及启动DNA合成有重要作用的Cyclin D3在卵巢癌、脑胶质瘤等肿瘤[14-15]中存在异常表达情况，但在NSCLC中的研究相对较少。Gu等[9]在对p44/WDR77影响细胞周期进程的研究中发现，在肺癌细胞系中下调p44/WDR77的表达，同时检测与G1期到S期过渡有关的9种调控因子，其中Cyclin D1的表达明显降低。基于已证实的结论，本研究推测与Cyclin D1具有相似结构的Cyclin D3，在调控细胞周期时同样受到p44/WDR77表达影响，最终促进NSCLC的发生发展。

本研究应用免疫组织化学法对190例NSCLC患者样本中p44/WDR77及Cyclin D3蛋白表达进行检测。结果显示，p44/WDR77和Cyclin D3经分别分析比较，二者均在NSCLC、腺癌及鳞癌组织的表达率明显高于正常组织，差异极其显著；但在腺癌及鳞癌间p44/WDR77和Cyclin D3表达差异均无统计学意义。提示p44/WDR77和Cyclin D3在NSCLC中的表达无癌组织种类差异性，但是与NSCLC的发生密切相关，为NSCLC的差异蛋白。

有研究报道，p44/WDR77表达不仅促进成长阶段小鼠的前列腺上皮分化[8，12]而且与老龄阶段的小鼠发生前列腺癌变有一定关系[16]。本研究发现，老年NSCLC患者(＞60岁)的p44/WDR77表达率明显高于中青年患者(≤60岁)，且差异显著；同时，p44/WDR77的表达强度与NSCLC的组织分化程度、TNM分期密切相关；其中，p44/WDR77在不同分化的鳞癌组织中差异同样显著。呈现出p44/WDR77在NSCLC组织低分化比高分化表达强度高、TNM分期高的比分期低的有高表达的趋势，其与Gu等[9]研究结果一致，即p44/WDR77表达水平随小鼠肺上皮细胞分化成熟而降低。

本研究发现，Cyclin D3作为调节细胞周期的重要蛋白，其表达率与患者年龄差异无统计学意义，但实验证实Cyclin D3的表达与NSCLC组织病理分级、TNM分期密切相关，而且表达强度趋势与p44/WDR77一致。众所周知，癌组织分化程度和TNM分期反映了疾病的侵袭性和进展程度，由此表明，在NSCLC细胞的生长、增殖及细胞的侵袭中，p44/WDR77与Cyclin D3表达起重要作用。此外，本研究提示，Cyclin D3高表达可能促进NSCLC淋巴结转移，而p44/WDR77表达和淋巴结转移与否无关。基于上述实验结论，本研究推测p44/WDR77表达存在促使NSCLC患者淋巴结转移的作用。

本研究对p44/WDR77与Cyclin D3表达进行了Spearman相关性检验显示，无论是NSCLC总体样本，还是肺鳞癌中，两种蛋白表达均呈正相关。表明p44/WDR77与Cyclin D3在NSCLC的发生发展过程可能起着协同作用，共同促进癌细胞的生长及转移。

p44/WDR77和Cyclin D3是NSCLC组织与相应正常组织表达的差异蛋白；二者表达的高低与细胞分化程度的高低、TNM分期及淋巴结转移与否相关。但是目前关于p44/WDR77及Cyclin D3蛋白相互作用机制尚无确切报道，通过文献资料结合本研究结果，推测p44/WDR77过表达可能上调Cyclin D3的表达，继而导致细胞周期失调，促进NSCLC的发生、发展及侵袭。然而，这一结论仍需通过体内外实验研究验证，今后将扩大样本量，对此进行后续的前瞻性研究。