辛伐他汀对去卵巢小鼠骨保护作用的实验研究*

王 晶 赵津璋 刘国良 李 微 周艳丽*

辛伐他汀属于羟甲基戊二酰还原酶抑制剂(hydroxy methyl glutary coenzyme A，HMG-CoA)， 是美国Merck公司以土曲霉菌的酵解产物合成而得，具有抑制内源性胆固醇的合成及调节血脂的作用，主要用于高血脂的治疗[1]。然而，近年来研究发现，辛伐他汀还有其他的药理活性，如扩张血管、促进骨代谢、抗血栓、抗氧化、抗炎等作用[2]。本研究通过观察辛伐他汀对去卵巢小鼠高转换的骨代谢状态的调节作用，分析辛伐他汀对骨代谢过程中骨形成和骨吸收指标的影响，为他汀类药物应用于骨病治疗提供数据支持。

1 材料和方法

1.1 实验动物

选取36只清洁级未孕雌性昆明小鼠，体重(20±3)g，8～10周龄，均购于黑龙江中医药大学药物安全性评价(good laboratory practice，GLP)实验中心，合格证号为SCXK(黑)2013-0004。

1.2 仪器设备与试剂

(1)仪器设备。双能X射线骨密度仪(美国HOLOGIC公司)；MUTISKAN MK3型酶标仪(美国赛默飞世尔科技公司)；实验设备还包括-20 ℃和-80 ℃冰箱、分析天平、显微镜、手术剪、骨剪、眼科镊、可吸收缝合线、缝合针、载玻片和盖玻片等。

(2)试剂。辛伐他汀片(商品名辛可，20 mg/片，广州南新制药有限公司)；苏木精(上海蓝季生物)；曙红Y(天津市天新精细化工开发中心)；酶联免疫(ELISA)骨钙素(bone glaprotein，BGP)试剂盒、酶联免疫(ELISA)TRAP5b试剂盒、酶联免疫(Elisa)骨源性碱性磷酸酶(bone alkaline phosphatase，BALP)试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物造模

(1)将适应性饲养3 d的小鼠采用随机分组法分为模型组(25只)和假手术组(11只)。手术前12 h，禁水处理。

(2)模型组小鼠采用10%水合氯醛腹腔注射(0.4 ml/100 g)，麻醉后取卧位，分别在背部脊柱两侧备皮。先在一侧背腹部行纵向切口约0.5 cm，依次切开皮肤、腰肌，找到白色发亮的脂肪团后，剥开脂肪即可看见淡粉色的菜花样卵巢，在子宫角上用可吸收手术缝合线结扎后，切断并摘除卵巢，然后依次缝合腰肌和皮肤；另一侧采用同样方法摘除卵巢。

(3)假手术组小鼠，除了摘除卵巢附近与卵巢大小相近的脂肪组织外，其余操作步骤均同模型组。

1.3.2 动物分组及给药

术后30 d，将模型组存活的小鼠(20只)随机分为模型组和干预组，每组10只，模型组给予生理盐水，干预组给予辛伐他汀混悬液，5.2 mg/(kg·d)；假手术组存活的小鼠10只，给予生理盐水。连续灌胃给药12周。

1.4 指标检测

术后第4～8 d，3组小鼠每日做阴道涂片，进行HE染色，观察各阶段阴道细胞形态，确定卵巢切除是否完全。然后摘取眼球取血，静置30 min后，置于4 ℃低温离心机，以13000 r/min，离心10 min。取上层血清，放置于-20 ℃冰箱内保存备用。取处死后的小鼠腰椎骨组织，剔除表面肌肉组织后迅速用浸透生理盐水的纱布包好，置于-80 ℃冰箱中冻存备用。采用双能X射线骨密度仪测定小鼠腰椎骨组织的骨密度(bone mineral density，BMD)。采用酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法测定小鼠血清中的BGP、BALP和TRAP5b含量。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行数据分析处理，数据以平均值±标准差s)表示。两组间比较采用t检验，采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，进行多组间比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 阴道涂片检查结果

根据阴道涂片结果判定卵巢摘除是否完全。卵巢摘除后的小鼠阴道涂片动情周期性变化消失，表现为大量的白细胞及少量的上皮细胞，处于动情间期。假手术组小鼠阴道涂片结果具有明显的周期性变化：①动情前期主要为完整的上皮细胞；②动情期均为大量角化细胞；③动情后期主要为角化细胞和白细胞共存；④动情间期以白细胞为主，伴有少数上皮细胞，各阶段典型特点结果如图1所示。

图1 假手术组小鼠动情周期阴道涂片细胞形态图(HE，×400)

2.2 BMD测定结果

模型组与假手术组比较，模型组的平均BMD为(0.095±0.010)g/cm2，假手术组的BMD为(0.141±0.013)g/cm2，两组比较差异具有统计学意义(t=0.00015，P＜0.01)，表明模型组小鼠的BMD明显下降。在辛伐他汀干预的条件下模型组小鼠BMD明显低于干预组(0.125±0.011)g/cm2，两组比较差异有统计学意义(t=0.00075，P＜0.01)，见表1，如图2所示。

表1 三组BMD测定结果比较

表1 三组BMD测定结果比较

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图2 三组BMD测定结果示图

2.3 血清生化指标检测结果

(1)BALP的含量测定。模型组血清中BALP活力为(21.831±3.028)金氏单位/100 ml，假手术组为(11.614±1.517)金氏单位/100 ml，两者有极显著性差异。干预组小鼠血清中的BALP活力为(18.052±2.586)金氏单位/100 ml，明显高于模型组，且差异具有统计学意义(t=0.0090，P＜0.01)，如图3所示。

图3 三组BALP含量测定结果示图

(2)TRAP5b的活力测定。模型组小鼠血清中TRAP5b活力为(45.597±6.302)U/L，假手术组为(32.552±3.167)U/L，两者差异有统计学意义(t=0.0002，P＜0.01)。干预组小鼠血清中TRAP5b活力为(35.724±4.701)U/L，与模型组比较，明显低于模型组，差异具有统计学意义(t=0.0012，P＜0.01，见表2，如图4所示。

表2 三组TRAP5b测定结果比较(U/L，

表2 三组TRAP5b测定结果比较(U/L，

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图4 三组TRAP5b活力测定结果示图

(3)BGP的含量测定结果。模型组小鼠血清BGP含量为(3.976±0.694)ng/ml，假手术组为(1.549±0.524)ng/ml，两者含量有极显著性差异。干预组小鼠血清中的BGP含量为(2.001±0.480)ng/ml，明显低于模型组，且差异显著，如图5所示。

3 讨论

他汀类药物主要用于治疗高血脂及心血管系统疾病，是羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂[3]。近年来研究发现，他汀类药物对BMD，骨代谢生化指标具有显著的疗效[4-5]。辛伐他汀作为早期发现的经典他汀类药物，经试验证实可通过多种途径治疗骨质疏松[6-7]。

骨吸收和骨形成的动态平衡是保证骨结构完整性的关键。骨质疏松症的发生是骨代谢的动态平衡受到破坏，主要表现为BMD下降以及血清中相关因子改变。BMD是骨质疏松症的诊断及治疗中的重要指标，能够衡量治疗骨质疏松药物的有效性[8]。血清中BALP和TRAP是骨代谢的主要相关因子，通过测量血清中两种酶的含量即可了解骨代谢状态。因此实验通过检测腰椎骨密度，以及血清中的骨代谢相关因子骨性碱性磷酸酶(BALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP5b)及BGP水平，来评估辛伐他汀对BMD及骨代谢过程的影响。

本实验结果表明，在小鼠卵巢摘除之后，其血清中骨形成的相关因子BALP活力升高；骨吸收的相关因子TRAP5b活力上升；BGP水平显著上升，表明卵巢摘除的小鼠，处于一种高转换的骨代谢状态，导致骨量的流失；同时小鼠BMD在卵巢摘除后也明显下降[9]。

本研究采用辛伐他汀对去卵巢小鼠进行干预治疗，实验结果证实，与模型组小鼠相比，BALP、TRACP、BGP和BMD的4个指标均得到了改善，表明辛伐他汀能够减缓卵巢摘除小鼠骨密度的下降、改善骨代谢、缓解骨丢失。

图5 三组BGP含量测定结果示图