鼻咽癌组织中LMP1和VEGF蛋白的检测结果及意义

张逸铮 鲁明 阮神炯 郑朝晖

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）为常见的头颈部恶性肿瘤，患者大部分来自东南亚地区以及我国南方地区，福建省是鼻咽癌的高发区之一，其病因和EB病毒（epstein-barr virus，EBV）感染、癌基因、抑癌基因结构及功能改变等多种因素密切相关，它的临床病理特点是低分化性与高转移性，癌症的侵袭及转移直接影响到该疾病的治疗效果。EB病毒感染和鼻咽癌之间的关系最为密切[1]，EB病毒潜伏膜蛋白1（latent membrane protent l，LMP1）是EBV在鼻咽癌细胞中起到重要作用的癌蛋白[2-3]，和鼻咽癌转移有密切关系，它通过对多条信号通路进行调控进而对鼻咽癌的侵袭以及转移产生不同程度的影响，并可通过活化不同信号通路促进肿瘤的淋巴结转移及远处转移，一直以来其为各个实验室分析研究的重点对象，同时发现LMP1是促进鼻咽癌发生和转移的主要基因之一，对预测鼻咽癌转移倾向有重要价值[4-5]。VEGF家族的不同成员是调节内皮细胞的调节因子，其具有控制内皮细胞存活、血管通透性、血管发生、淋巴血管生成以及血管生成的作用[6]。本次研究主要通过检测鼻咽癌组织中LMP1蛋白与VEGF蛋白的表达，以及血清中VEGF的表达，以了解鼻咽癌的发生、发展、浸润和转移复发等生物学特性，从而为鼻咽癌的综合治疗以及基因治疗提供参考，内容如下。

1 资料和方法

1.1 资料

收集福建医科大学附属第二医院2014年1月—2016 年12月经病理确诊为鼻咽癌和鼻咽部腺样体切除组织的归档石蜡包埋块，其中鼻咽癌22例，鼻咽腺样体标本14例。将石蜡重新切片HE染色后，再次经本院病理科两位医师诊断证实并进行病理分型。将收集的组织标本分为鼻咽癌组和对照组，再将鼻咽癌组中的组织标本分为伴有颈部淋巴结转移组和不伴有颈部淋巴结转移组。详细病例数如下：鼻咽癌组22例，其中男13例，女9例，年龄25～72岁，平均年龄为（45.00±12.92）岁；伴颈部淋巴结转移鼻咽癌组织标本15例，不伴颈部淋巴结转移鼻咽癌组织7例；鼻咽癌组织标本病理分型：非角化性癌分化亚型5例，非角化性癌未分化型17例；根据国际抗癌联盟（UICC）头颈肿瘤临床分期第6版（2002年）对鼻咽癌进行TNM分期：Ⅰ/Ⅱ期9例、Ⅲ/Ⅳ期13例；鼻咽炎组14例，其中男7例，女7例，年龄26～58岁，平均年龄为（42.93±12.56）岁。所有患者在收集组织标本时均未接受过放疗、化疗等临床治疗，鼻咽癌患者有无颈部淋巴结转移根据患者磁共振（MRI）和CT检测报告确定，对照组标本来源于腺样体切除后标本。本研究经过福建医科大学附属第二医院伦理委员会审查通过。

1.2 方法

用免疫组化方法测定LMP1蛋白水平，主要包括石蜡切片预处理准备、切片抗原修复、消除内源性过氧化物酶、非特异性封闭、免疫反应以及显色复染。用酶联免疫吸附法测定VEGF蛋白水平，抽取患者4 mL外周静脉血，在4℃3 000r/min离心10 min，将分离出的血清保存于-70℃中保存，随后用VEGF-ELISA试剂盒进行检测，严格按照试剂盒说明书进行，显色后用酶标仪比色测定OD值，根据矫正曲线求出VEGF数值。

1.3 统计学分析

使用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计分析，计数资料用（n，% ）描述，组间差异比较采用χ2检验，不适用χ2检验，则采用Fisher确切概率法；计量资料用（x-±s）表示，采用t检验；P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 鼻咽炎组和鼻咽癌组中LMP1蛋白的表达

利用免疫组化法检测对照组和不同淋巴转移分期（不同N分期）的鼻咽癌组中LMP1蛋白的表达水平。鼻咽癌组中LMP1蛋白表达的阳性率为68.18% （15/22），在对照组中LMP1蛋白表达的阳性率 14.29% （2/14）；对各组LMP1蛋白的表达水平进行对比，鼻咽癌组LMP1蛋白的表达高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 鼻咽癌伴或不伴淋巴结转移组中LMP1蛋白的表达

鼻咽癌组中伴有淋巴结转移的LMP1蛋白表达阳性率为73.33% （11/15），鼻咽癌组中不伴有颈部淋巴结转移的LMP1蛋白表达阳性率为57.14% （4/7）。鼻咽癌组伴有颈部淋巴结转移鼻咽癌中LMP1蛋白的表达水平和不伴有颈部淋巴结转移鼻咽癌中的表达水平之间差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 不同临床参数鼻咽癌组中LMP1蛋白的表达情况

采用Fisher确切概率法分析鼻咽癌各临床参数中LMP1蛋白的表达分布情况，发现在鼻咽癌患者性别、年龄、病理分型中LMP1蛋白的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。在鼻咽癌的TNM分期中LMP1蛋白的表达差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

2.4 鼻咽炎组和鼻咽癌组中VEGF蛋白的表达

VEGF在鼻咽癌组织中阳性表达率为59.09% （13/22），显著高于鼻咽炎组7.14% （1/14），差异具有统计学意义（P＜0.05）。有颈淋巴结转移的鼻咽癌组织中VEGF阳性表达率为73.33% （11/15），无颈淋巴结转移的鼻咽癌组织中VEGF阳性表达率为28.57% （2/7），差异具有统计学意义（P＜0.05），见表4。

2.5 不同临床参数鼻咽癌组血清中的VEGF蛋白的表达情况

ELISA法检测血清VEGF蛋白水平，结果表明鼻咽癌患者血清VEGF水平为（468.31±20.23）ng/L，高于对照组（65.13±22.42）ng/L，差异具有统计学意义（t=55.906，P＜0.001）；血清VEGF水平有淋巴结转移者显著高于无转移者（t=3.708，P＜0.001）；晚期（III+IV期）患者血清VEGF水平显著高于早期（I+II期）患者（t=9.556，P=0.038）；VEGF水平与患者性别以及年龄差异无统计学意义（性别t=0.093，P=0.927；年龄t=0.828，P=0.418），见表5。

3 讨论

在中国，鼻咽癌有非常明显的区域分布特征，大部分集中于我国南方五省：广东、广西、福建、江西以及湖南省[7]，在这些地区，鼻咽癌的发病率占头颈部恶性肿瘤之首。近年来，鼻咽癌的发病率有上升的趋势，且好发于鼻咽顶后壁，其次为侧壁。鼻咽癌的发生主要和三个因素有关，分别是遗传、环境以及病毒因素[8]。

表1 鼻咽炎组和鼻咽癌组中LMP1 蛋白的表达[例（% ）]

表2 鼻咽癌伴或不伴淋巴结转移组中LMP1 蛋白的表达[例（% ）]

表3 不同临床参数鼻咽癌组中LMP1蛋白的表达情况[例（% ）]

表4 鼻咽癌伴或不伴淋巴结转移组中VEGF蛋白的表达[例（% ）]

表5 不同临床参数鼻咽癌组血清中的VEGF蛋白的表达情况[（x±s）]

研究发现鼻咽癌在发生颈部淋巴结转移的过程中，EB病毒能够发挥多种作用，如持续不断的表达癌蛋白，降解细胞外面的基质，减少细胞之间的粘接，在异常细胞的转移中发挥非常关键的作用[9]。这类病毒中最为突出的是LMP1蛋白，其促进了肿瘤血管生成并推动了癌细胞的转移扩散，属于癌基因的一种。EB病毒是非常常见的疱疹病毒，大部分人都是隐性感染状态[10-11]。EB病毒潜伏膜蛋白1（LMP1）是肿瘤坏死因子受体超家族的成员，被认为是EBV的主要致瘤蛋白，它是一种整合膜蛋白，它包括CTAR-1、CTAR-2以及CTAR-3三个功能区，三个功能区利用存在于细胞膜和高尔基体中的物质活化多种信号通路促进鼻咽癌的发生发展[12]。LMP1能够提高鼻咽癌细胞的运动能力，利用细胞内的信号转导系统对细胞基质进行降解，增大癌细胞的侵入以及转移能力。本研究应用免疫组化检测鼻咽癌组和对照组中LMP1蛋白表达水平，鼻咽癌组LMP1 蛋白表达阳性率明显高于对照组LMP1 蛋白表达阳性率，其差异有统计学意义。但LMP1蛋白的表达与年龄、性别、病理分型无明显相关性，表达无统计学意义。通过统计分析比较在鼻咽癌组中伴有颈部淋巴结转移者LMP1的阳性率和无颈部淋巴结转移者LMP1的阳性率无明显差异，与龚梁研究结果不一致，通过对该实验讨论分析，出现该结果可能有如下原因：本实验对照组及实验组样本数量偏少，尤其是对照组，而且后期询问抗体公司发现抗LMP1单克隆抗体特异性不强，以致对LMP1蛋白在有无颈部淋巴结转移中的阳性率产生偏差，但LMP1蛋白表达阳性率在鼻咽癌组仍大于对照组阳性率，仍具有一定的参考意义。建议后期使用原位杂交技术来检测EBV病毒的mRNA更具有代表性。

VEGF是一种有效的血清形成和通透性诱导因子，其在人体的许多正常组织中低水平表达，在多种实体瘤等病理情况下，其表达异常升高，而且随着肿瘤恶性程度增加而呈现递增的趋势。在本次研究中 VEGF在鼻咽癌组织中阳性表达率为73.33% （11/15），显著高于对照组28.57% （2/7），差异具有统计学意义（P＜0.05）；有颈淋巴结转移的鼻咽癌组织中VEGF阳性表达率为73.33% （11/15），无颈淋巴结转移的鼻咽癌组织中VEGF阳性表达率为57.14% （4/7），差异具有统计学意义（P＜0.05）；血清VEGF水平有淋巴结转移者显著高于无转移者（P＜0.05）；晚期（III+IV期）患者血清VEGF水平显著高于早期（I+II期）患者（P＜0.05）；VEGF水平与患者性别以及年龄差异无统计学意义（P＞0.05），提示VEGF表达水平可作为判断鼻咽癌淋巴结转移的重要指标。

综上所述，鼻咽癌是人类一种复杂的恶性肿瘤，相关癌基因和相关抑癌基因的异常参与了鼻咽癌的发生、发展、侵袭和转移等过程。