N6-甲基腺苷甲基化及其与肿瘤关系的研究进展

胡威，祝恒成

(武汉大学人民医院，武汉430060)

甲基化是甲基(-CH3)添加到一个分子上，并在核酸上观察到甲基化基团。DNA、RNA和多种蛋白质，包括组蛋白均可甲基化。DNA甲基化主要是在启动子区域，而组蛋白甲基化对生物体的影响主要取决于甲基化水平和甲基化残基在组蛋白上的位置[1]。除了DNA和组蛋白的甲基化，另一个水平的表观遗传调控已成为近几年来生命科学领域的研究热点，即RNA甲基化。RNA甲基化是真核细胞表观遗传的关键过程，决定其组蛋白结构和基因表达[1,2]。RNA甲基化是RNA修饰中最重要的一种，目前已探明的RNA修饰超过100种。RNA甲基化可存在于多种RNA分子中，如mRNA、tRNA、rRNA、miRNA、小分子RNA、端粒酶RNA、反义RNA、核酶和非编码RNA等，但主要存在于mRNA中，mRNA甲基化主要用于维持mRNA的稳定性[2，3]。RNA甲基化修饰在mRNA处理(剪接、多聚腺苷酸化等)、定位、小RNA处理、tRNA稳定和翻译抑制或激活中均起重要调节作用。这些规则对组织发育、昼夜节律、DNA损伤反应、性别选择及包括肿瘤在内的多种疾病发生发展均有较大影响。mRNA最常见的内部修饰包括N6-甲基腺苷(m6A)甲基化、5-胞嘧啶(m5C)甲基化等。m6A甲基化是一种动态、可逆的修饰，其涉及真核细胞的多种生理过程，如mRNA及miRNA加工、mRNA定位、翻译抑制或激活。m6A甲基化影响机体多种重要的生物过程，如组织发育、性别选择和DNA损伤反应等[1～3]，现将m6A甲基化及其与肿瘤关系的研究进展综述如下。

1 m6A甲基化

modomics数据库是一个基于网络的数据库，包含与RNA修饰途径相关的信息。迄今为止，已有171个RNA修饰被描述，其中包括72个甲基化修饰[4]。mRNA最常见的内部修饰包括m6A甲基化、m5C甲基化等。m5C甲基化是将甲基添加到胞嘧啶核苷酸的第5位碳(C)原子，m6A甲基化即将甲基添加至碳环腺苷酸的第6位氮(N)原子[5，6]。

m6A甲基化最初在20世纪70年代被确定，是最丰富的转录后修饰，占总RNA修饰的50%以上。由于受技术条件限制，其早期研究较困难。随着高通量测序技术的快速发展及表观遗传学研究领域的逐步深入，m6A甲基化在不同生物学过程中的功能和作用再次受到关注。近年来，高等真核生物特别是mRNA分子的主要内部修饰越来越引起重视。通过m6A甲基化对蛋白质结合的影响，将影响mRNA分子剪接、定位、多腺苷酸化、翻译、衰变的每一步。

m6A甲基化有别于其他mRNA内部修饰(如m5C)，其在不改变碱基序列的情况下对基因转录后表达水平进行调控，通过影响mRNA与读取蛋白的结合，从而调控mRNA的剪接、翻译和稳定。m6A甲基化过程可逆，可精确调控，这一独特过程是通过以下途径实现的。①甲基化，加入甲基转移酶的酶(读取蛋白，Writer)；②去甲基化，即去除甲基，通过去甲基酶(擦除蛋白)将甲基从碳环上剥离；③识别发生甲基化修饰的RNA碱基位点，并绑定它们，执行特定的生物功能(结合蛋白)[7,8]。目前已发现的读取蛋白主要有甲基转移酶-Like家族METTL3、METTL4、METTL14、WTAP(Wilms肿瘤结合蛋白)和KIAA1429、RBM15、CBLL1、2C3H13等[7～9]。已发现的擦除蛋白仅有脂肪质量和肥胖相关蛋白(FTO)、ALKB家族同系物5(ALKBH5)[10,11]。结合蛋白主要有YTH家族的蛋白YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1等[12,13]。

如上所述，完成m6A甲基化过程，需读取蛋白、擦除蛋白、结合蛋白共同参与。这三种蛋白并不是单一的蛋白，而是三种大蛋白质复合物合并在一起，再组成一个超大的蛋白质复合物。读取蛋白蛋白质复合物负责在腺苷残基芳环第6个碳上向甲基中加入甲基，该复合物含有由METTL3、METTL4和METTL14蛋白组成的核心结构，具有甲基转移酶活性[14]。另一种蛋白，Wilms肿瘤相关蛋白(WTAP)亦包括在该复合物中。其与METTL3、METTL4、METTL14相互作用，是定位于富含前mRNA加工因子的核斑点和体内m6A甲基转移酶的催化活性所必需。除了METTL3、METTL14和WTAP、RBM15、KIAA1429等蛋白外，ZC3H13和CBLL1亦存在于m6A甲基转移酶复合物中。尽管很早就鉴定了m6A甲基转移酶复合物(读取蛋白)的组分，但直至2010年才在高等真核细胞中鉴定出m6A去甲基化酶(擦除蛋白)，并发现FTO和ALKBH5为哺乳动物仅有的两种去甲基化酶(擦除蛋白)[10,11]。在体外和体内均可通过氧化逆转mRNA中的m6A甲基化过程。这一发现表明m6A修饰是可逆的，并且是动态调节的。m6A可通过调节多种RNA相关细胞途径来影响基因表达，并决定RNA在细胞中的命运，能使细胞对各种环境信号产生快速反应，包括哺乳动物的能量来源[14,15]。

一旦m6A甲基化修饰过程启动，部分细胞质和细胞核蛋白(结合蛋白)将识别修饰位点并绑定到RNA上以执行其特定的功能。目前已被鉴定的主要结合蛋白是含YT521-B同源(YTH家族)结构域的蛋白质,包括YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3等[14，16]。绑定不同YTH结构域家族蛋白将对m6A位点的不同亚群产生不同影响,并导致其对基因表达产生不同影响。如YTHDF2的结合导致结合的mRNA定位于mRNA衰变位点,导致m6A修饰的mRNA稳定性降低和转换增加,另一方面，YTHDF1与修饰的mRNA结合并通过与翻译启动因子eIF3相互作用,而促进蛋白质合成。YTHDF3则能与YTHDF1、YTHDF2协同作用，当与YTHDF1、YTHDF2结合时，其分别加速mRNA的衰变和翻译启动过程[14]。

除了调节mRNA的功能外，m6A甲基化亦参与了前体miRNA(pri-miRNA)的加工。研究发现，m6A识别酶(HNRNPA2B1)将mRNA微处理器复合蛋白募集到经m6A甲基化修饰的RNA位点，并将原代pri-miRNA加工成成熟的miRNA。生物物理学研究表明，m6A修饰亦可对RNA结构产生直接影响。未修饰的腺苷残基可与RNA结构中的相邻碱基形成键。但当用m6A甲基化修饰残基时，这使RNA双链体结构(发卡状RNA)不稳定，将导致与m6A位点相邻的碱基倾向于断裂形成单链。反之，通过控制m6A甲基化进程可间接控制发卡状RNA的稳定性，这种现象称为“m6A开关”[15,17]。

2 RNA甲基化的检测方法

虽然RNA甲基化的研究很早就已启动，但由于技术上的限制一直停滞不前。直到最近几年随着高通量测序及分析化学工具的升级，加快了RNA修饰的研究。目前已开发了几种用于检测RNA甲基化的方法，有基于亚硫酸氢盐修饰和非甲基化胞嘧啶化学修饰；有二代测序方法，如亚硫酸氢盐测序、焦磷酸测序；也有传统的、经济的基于PCR的方法，如利用扩增片段长度的多态性或限制性片段长度的多态性等。RNA结构和代谢的RNA甲基化鉴定需要与新颖的高通量方法相结合。由于经亚硫酸氢盐处理后的非甲基化胞嘧啶残基可转化为尿嘧啶，m5C修饰可轻松被检测到。基于此原理，已有多种检测方法并广泛使用。然而，与m5C不同，m6A甲基化无化学转化过程，缺乏用于检测RNA修饰及其静态、不可逆性质的敏感方法。斑点印迹和高效液相色谱与三重四极杆质谱相结合可能成为检测m6A修饰的有用工具。但这些技术不适合识别修饰位点的定位[18～23]。微量RNA全转录组m6A图谱分析(m6A-seq/MeRIP-seq)，是一种免疫沉淀法，是识别m6A的重要工具，该工具具有准确性和可重复性，且所需的MeRIP-seq总RNA起始量低，仅需500 ng。通过与免疫沉淀反应相结合的极小RNA片段(100～200 nt)将m6A-seq/MeRIP-seq法进一步改进，分辨率进一步提高，可直接定位到单个核苷酸。改进后的方法被称为单个m6A-核苷酸-拆分-交联和免疫沉淀法(miCLIP)。miCLIP现已用于多种类型细胞及生物中m6A的定位，揭示其潜在功能[23]。此外，研究人员已建立可预测m6A甲基化信息的数据库，名为RMBaseV2.0数据库(http://rna.sysu. edu.cn/rmbase/)，其收录了13个物种的多个RNA表观遗传修饰的测序数据及m6A甲基化的具体位点。随着检测m6A甲基化位点的技术不断提高，为研究m6A甲基化与各类疾病的关系提供了实验室依据。

3 m6A甲基化与肿瘤的关系

肿瘤的主要标志是基因表达的异常。m6A对控制细胞分化和多样性有重要作用。最近研究强调，m6A不仅通过调控基因表达影响癌症的发展，其还影响癌症干细胞分化的多样性，广泛参与肿瘤细胞的增殖、转移和潜在的肿瘤免疫等过程，这使其成为一种新的、前景广阔的肿瘤治疗途径[3，12,14]。

METTL3、METTL14、NSun2、FTO、ALKBH5、YTHDF2被认为是不同类型肿瘤中的异常甲基化分子。目前研究报道较多的是造血干细胞，造血干细胞具有多种分化途径以达到其最终分化状态，m6A甲基化可改变其正常的分化途径，并导致异常祖细胞状态。研究表明，与正常人造血干/祖细胞(HSPCs)相比，急性髓细胞性白血病(AML)细胞中METTL3 mRNA和蛋白表达升高。下调AML细胞系中的METTL3基因表达,能诱导细胞凋亡和分化，从而延缓患者白血病的进展。与METTL3(m6A甲基转移酶复合物的另一个关键组分)一样，METTL14亦在正常HSPCs和AML细胞中高表达，并在骨髓分化过程中表达下调。在HSPCs和AML细胞中沉默METTL14基因可促进末端骨髓分化,并抑制AML细胞的存活和增殖[17,18]。

另一方面，作为m6A脱甲基酶(擦除蛋白)的FTO在部分AML细胞中高表达。在FTO介导的m6A RNA甲基化水平降低时mRNA稳定性同时降低，这将导致细胞因子信号传导盒2和视黄酸受体α两种基因表达受抑制，从而延缓AML发生发展。研究发现，降低m6A mRNA表达对于维持胶质母细胞瘤细胞(GSC)生长、自我更新和肿瘤发生发展至关重要。敲低METTL3或METTL14的表达能降低其靶基因m6A mRNA的表达。此外，通过抑制擦除蛋白FTO基因表达可抑制肿瘤进展并延长GSC移植小鼠的寿命。另外擦除蛋白ALKBH5基因还影响GSC细胞周期，ALKBH5在GSC组织中高表达，能使叉头框蛋白M1(FOXM1)新生转录物去甲基化，这将影响mRNA的稳定性，导致FOXM1蛋白表达下降。FOXM1是FOX转录因子家族中的一员,在细胞周期中扮演重要角色。FOXM1特异性高表达于增殖期细胞和多数恶性肿瘤细胞中，但在细胞静止、分化末期不表达[14,15,17]。

乳腺癌细胞MCF-7暴露于缺氧环境可刺激缺氧诱导因子HIF-1α和HIF-2α依赖性的去甲基酶(擦除蛋白)ALKBH5的表达。ALKBH5通过m6A去甲基化影响NANOG基因mRNA的稳定性。NANOG基因是一种多能性因子，2003年在胚胎干细胞中新发现的重要基因，是维持癌症干细胞所必需的。所以，增加m6A去甲基化将会影响乳腺癌干细胞的表型。此外，乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白(HBXIP)能通过抑制乳腺癌中let-7g家族miRNA表达,上调读取蛋白METTL3的表达，升高的METTL3又反过来增加HBXIP的表达，形成正反馈循环，导致乳腺癌细胞增殖加速。另一方面，在肝细胞癌(HCC)组织中，METTL3的过表达能抑制细胞因子信号转导抑制因子2(SOCS2)，并通过m6A-YTHDF2途径促进肿瘤生长。然而，m6A读取蛋白的另一个成分METTL14能促进miR-126的表达，抑制肿瘤转移。因miR-126可抑制HCC细胞转移[18,19]。

结合蛋白YTHDF2的mRNA及蛋白在人胰腺癌细胞中较正常细胞表达上调，并通过Akt/GSK-3β/Cyclin D1信号通路，促进胰腺癌细胞增殖，同时通过抑制上皮细胞-间质转化来抑制癌细胞的增殖、迁移和黏附。所以YTHDF2起到协调胰腺癌细胞迁移、增殖的作用。此外，m6A甲基化能影响前体RNA-premiR125b并降低成熟miR-125b表达，导致其靶基因产物如生长因子受体结合蛋白2表达增加，并促进癌细胞迁移[20～22]。

总之，m6A甲基化和肿瘤发生发展关系的研究目前尚处于起步阶段，仅部分血液系统疾病、神经系统疾病等报道较多，其他报道较少[24～26]。主要原因为m6A甲基化过程所涉及的基因过多。m6A修饰过程需要读取蛋白、擦除蛋白、结合蛋白这三类基因共同参与，且每种基因在不同癌症中的表现可能千差万别，如FTO基因在胶质母细胞瘤表现为癌基因，通过抑制FTO基因表达可抑制肿瘤进展；但在肾肿瘤或其他肿瘤组织中FTO可能为抑癌基因。此外由于擦除蛋白类的基因本身自带去甲基化功能，过表达FTO基因，可能会导致细胞或组织m6A甲基化减少，反过来导致读取蛋白或结合蛋白这两类基因中的潜在癌基因或抑癌基因表达下调，将加速或减缓肿瘤发生发展。m6A甲基化过程在不同肿瘤中的表现可能千差万别，需要进一步将研究精细化，并进一步了解读取蛋白、擦除蛋白、结合蛋白在肿瘤中的作用机制及相互影响。另外，读取蛋白、擦除蛋白、结合蛋白间的联系，为研究提供了新的思路，对肿瘤的调控更精细化、多样化，可同时实现对癌基因及抑癌基因的精准化、可逆化、动态调控。此外，m6A甲基化将肿瘤的诊断、治疗提高到了分子水平。对m6A甲基化位点的研究可协助寻找新的分子诊断、治疗的靶点，为临床提供新思路。