凋亡相关蛋白、信号通路在肾小管上皮细胞凋亡中的作用机制研究进展

王城，何平，彭沁雪

(中国医科大学附属盛京医院南湖院区，沈阳110004)

自从Kerr等[1]根据细胞发生了和坏死完全不同的过程而提出凋亡这个概念以来，凋亡开始成为医学领域的研究热点。按照细胞死亡命名委员会(NCCD)最新的定义[2]，凋亡分为内源性凋亡和外源性凋亡。这基本对应了两条经典的凋亡途径，即内源性途径(也称为线粒体途径)和外源性途径(也称为死亡受体途径)。在病理生理条件下，不管是肾小管局部的缺血、缺氧、尿蛋白超载、药物毒性作用，还是全身系统的高血糖、高尿酸，甚至病毒感染等，均可作为直接或间接因素诱导肾小管上皮细胞凋亡，进而引起急性肾损伤或慢性肾脏疾病[3～5]。但是，肾小管上皮细胞凋亡的分子机制仍未明确。目前文献报道其相关凋亡蛋白主要有Bcl-2蛋白家族、死亡受体半胱氨酸蛋白酶(caspase)，凋亡相关信号通路主要有丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、酪氨酸激酶(JAK)-转导和转录激活因子(STAT)信号通路、3-磷酸肌醇激酶(PI3K)-丝氨酸/苏氨酸激酶 (Akt)信号通路等。为了解肾小管上皮细胞凋亡机制，本研究对以上蛋白及信号通路在肾小管上皮细胞凋亡中的作用进展作以下综述。

1 细胞凋亡概念、分类

传统形态学意义上的凋亡具有细胞皱缩、核固缩、核碎裂、质膜空泡以及凋亡小体(apoptotic bodies)形成等特点，随着生物化学试验技术以及基因检测技术的发展，将细胞死亡按照形态学分类已经无法适应层出不穷的新发现，故而2012年开始NCCD,在可测量的生化特点的基础上将死亡形式进行了新的分类,凋亡被分为内源性凋亡和外源性凋亡，还进一步将内源性凋亡分为caspase依赖性和非依赖性凋亡，这一定程度上是因为凋亡诱导因子(AIF)可以诱导凋亡而不依赖caspase。然而，事实上有研究团队[6]发现AIF以及EndoG是以一种caspase依赖的方式参与凋亡过程的。另一方面，随着研究进一步深入，科学家们发现AIF更多地参与了聚腺苷二磷酸核糖聚合酶依赖性细胞死亡等新的细胞死亡形式。从2015年开始，NCCD将凋亡定义为一种caspase依赖的调控性细胞死亡方式。需要注意的是，程序性细胞死亡不同于调控性细胞死亡，也不完全等同于凋亡。程序性细胞死亡特指调控性细胞死亡中参与生物发育及维持机体稳态的部分，在形态学上既可以表现为凋亡的特点，也可以表现为其他形式。内源性凋亡以线粒体外膜透化(MOMP)形成为特点，主要是由各种各样的微环境改变引发的，包括但不限于生长因子分泌不足、DNA损伤、内质网应激、活性氧超载等[2]，Bcl-2蛋白家族是主要调控因子。失巢凋亡是内源性凋亡的一种特殊形式[2]，肾小管上皮细胞中也发现了这种凋亡[7]。外源性凋亡是由细胞外微环境改变引起的，主要由两种质膜受体驱使，即死亡受体和依赖性受体，后者在肾小管上皮细胞凋亡中鲜有报道。内源性途径和外源性途径最终走向一条共同途径或称之为凋亡执行阶段,该阶段涉及到一系列caspase的激活。caspase-3的激活是内源性凋亡和外源性凋亡的共同特征，有了caspase-3的激活凋亡才得以继续进行[2]。需要注意的是，两条凋亡途径不是单纯线性独立存在的。在外源性途径中，caspase-8的激活可以引起BID的激活，后者可以通过寡聚化Bax和Bak从而使内源性凋亡继续进行[8]。线粒体是参与上述凋亡途径的主要细胞器，但内质网、溶酶体、细胞核等也参与了细胞凋亡[9]。

2 凋亡相关蛋白、信号通路在肾小管上皮细胞凋亡中的作用机制

肾小管上皮细胞凋亡的分子机制十分复杂，其凋亡途径主要有内源性凋亡途径、外源性凋亡途径以及凋亡共同途径，其主要相关凋亡蛋白有Bcl-2蛋白家族、死亡受体、caspase。此外，MAPK、JAK-STAT、PI3K-Akt等多种信号通路也参与其中。研究凋亡相关蛋白及信号通路中的一系列分子有助于了解肾小管上皮细胞凋亡机制。

2.1 凋亡相关蛋白在肾小管上皮细胞凋亡中的作用机制

2.1.1 Bcl-2蛋白家族 Bcl-2蛋白家族是内源性凋亡的主要调控因子,通常分为两大类。第一大类为抗凋亡蛋白(例如Bcl-2、Bcl-XL、MCL1等)，它们均包含4个不同的BH同源结构域，可以通过拮抗促凋亡蛋白发挥抗凋亡作用。第二大类为促凋亡蛋白，既包括Bax和Bak这些同样含有四个BH同源结构域的蛋白，也包括BH3-only蛋白(例如tBID、BAD、PUMA)，仅含有1个BH3结构域。目前认为，BH3-only可以通过直接与Bax和Bak结合使其发生一系列构象改变，使其寡聚化，进而形成MOMP，MOMP形成后，线粒体通透性增加，细胞色素C释放到胞质中去,进一步形成“凋亡体”，最终激活caspase-3引起细胞凋亡[2]。最近的一项研究[4]发现，在近端小管上皮细胞中，高糖可以通过上调凋亡调节蛋白的表达诱导凋亡。在肾小管上皮细胞中，Bax和Bak是增加线粒体通透性的主要调控者，而Bcl-2和Bcl-XL可以通过增强线粒体外膜的稳定性拮抗它们的效应[10]。Bax/Bcl-2是评估凋亡的良好指标，被广泛应用在肾小管上皮细胞凋亡研究中[11,12]。近来有学者[13]通过免疫组化的方法，发现Bax/Bcl-2指标的变化还可以作为狼疮肾炎患者疾病进展的一项监测指标。促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的失衡决定了凋亡是否发生，但它们之间不是简单的“敌进我退”关系，Bax/Bcl-2增高时，既可以有Bax表达增加，也可以有Bcl-2表达增加。

2.1.2 死亡受体 死亡受体是肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的一部分，常见的有TNFR1、FAS、TRAILR1等，它们通过和相应配体结合，促进或抑制凋亡的信号传导。死亡受体途径引起凋亡的信号传导方式大同小异。例如，FasL和Fas结合成为牢固的三聚体，使其位于细胞内的尾部结构发生构象改变，从而使它的死亡结构域能够和衔接蛋白Fas相关死亡结构域(FADD)的死亡结构域结合，FADD反过来可以通过它的死亡效应区募集procaspase-8、细胞FLICE抑制蛋白(c-FLIP)等形成所谓的死亡诱导信号复合体(DISC)[2]。c-FLIP是一类抗凋亡蛋白，参与构成死亡诱导信号复合体，短链的c-FLIP蛋白表达增加可以抑制FAS介导的细胞死亡，可能是通过与procaspase-8形成无活性的异源二聚体实现的[14]。尽管死亡受体途径本身有套路，但其上游信号通路却是复杂的。Wang等[15]发现，肾脏缺血再灌注使沉默信息调节因子2(SIR2)活化，活化的SIR2可以让转录因子FOXO3a去乙酰化，进而促进其表达增加并转移到细胞核，最终通过增强FasL的表达引起肾小管上皮细胞凋亡。最新的一项研究[5]表明，乙型肝炎病毒X蛋白与炎症因子通过协同作用显著增强TRAIL介导的肾小管上皮细胞凋亡，是通过NF-κB激活后上调DR4表达实现的。

2.1.3 caspase caspase激活贯穿外源性途径和内源性途径，caspase-3的激活是内源性凋亡和外源性凋亡的共同特征。caspase是一组半胱氨酸蛋白酶，目前为止共有13种在人类中被证实，通常认为和凋亡相关的有(caspase-2，-3，-6，-7，-8，-9，-10)。根据caspase在凋亡过程中发挥的作用，可以将上述几个蛋白分为起始者和执行者,前者以caspase-9和caspase-8为代表，后者以caspase-3为代表。MOMP形成后，原本位于线粒体膜间隙的细胞色素C释放到胞质中去,和凋亡蛋白酶活化因子、caspase-9前体共同形成“凋亡体”,活化caspase-9，再激活执行者caspase-3而引起细胞凋亡[2]。实验[16]表明，食品添加剂对氨基苯胂酸(俗称阿散酸)可以通过激活caspase-9和caspase-3途径导致肾小管上皮细胞凋亡，这可能是其引起肾毒性的机制。XIAP是另一种抗凋亡蛋白，系人类凋亡抑制蛋白家族(IAP)的重要一员，IAP中只有它可以通过和caspase紧密结合从而根本上阻断其酶链反应[2]。在所谓的“Ⅱ型细胞”中，caspase-3和caspase-7被高表达的XIAP抑制，外源性凋亡需要通过caspase-8水解BID以激发内源性凋亡途径来保证凋亡的发生[2,17]。多个研究[17,18]证实，肾小管上皮细胞属于“Ⅱ型细胞”,例如，Kirstin等在实验中证实FasL促进了procaspase-8、FLIP、BID的表达。反过来，在IAP拮抗剂存在的条件下，FasL仍然能够以caspase-8途径发生。事实上，MOMP除了可以引起细胞色素C的释放，还能引起半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶激活剂(SMAC/DIABLO)释放到胞质中。SMAC是一种天然的XIAP拮抗剂。实验[19]表明，热休克蛋白72可以通过抑制SMAC释放并增强XIAP稳定性减少肾小管上皮细胞凋亡。总之，caspase是肾小管上皮细胞凋亡机制的核心内容，通过和SMAC、XIAP等凋亡调节蛋白相互制衡巧妙而精细地控制凋亡的发生、发展。

2.2 凋亡相关信号通路在肾小管上皮细胞凋亡中的作用机制

2.2.1 MAPK信号通路 MAPK是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可以将细胞的胞外信号呈递给细胞核，通过调控相关基因广泛参与炎症、细胞分化、细胞增殖、细胞死亡等。在哺乳动物细胞中已知至少3种MAPK信号通路，包括细胞外信号转导信号激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、p38激酶(p38MAPK)，它们均参与了肾小管上皮细胞凋亡[10,20]。肾小管上皮细胞凋亡与急性肾损伤及肾脏纤维化关系是目前的研究热点，但具体的分子机制仍有待进一步研究。研究[12]表明，中草药提取物大黄素可通过抗氧化作用降低MAPK磷酸化水平来减轻肾小管上皮细胞凋亡，起到保护肾脏的作用。但另一项研究[21]表明，低温诱导的ERK磷酸化可减少肾小管上皮细胞凋亡，有助于减轻缺血再灌注损伤造成的肾脏损害。Wu等[22]发现，在糖尿病小鼠模型中，加入c-Scr抑制剂后，肾小管上皮细胞凋亡减轻，可能是通过抑制p38MAPK信号通路实现的。一项新近的研究[23]表明，在狼疮肾炎小鼠模型中，miR-485可作用于p38MAPK信号通路的上游分子RhoA，通过RhoA介导的TGF-β-MAPK 信号通路调控肾小管上皮细胞凋亡。JNK活化后既可以通过激活FasL促进肾小管上皮细胞凋亡[15]，也可以通过增加细胞色素C的释放促进肾小管上皮细胞凋亡[20]。还有研究[10]表明，在缺氧条件下，二苯基氯化碘盐可通过ERK信号通路上调Bcl-2的表达而阻断肾小管上皮细胞凋亡。综上，MAPK信号通路广泛参与肾小管上皮细胞凋亡，但在具体作用靶点的细节问题上仍有待进一步研究。

2.2.2 JAK-STAT信号通路 JAK/STAT信号通路广泛参与细胞活动，如细胞增生、分化、凋亡及免疫应答等，其上游分子包括各种细胞因子和生长因子。细胞因子或生长因子和相应的受体结合后，可以激活JAK，进而使STAT形成二聚体，转移到细胞核内，调控下游基因的表达。目前发现，哺乳动物细胞中JAK激酶主要有4种，STAT家族共有7种，其中与肾脏疾病最相关的是JAK2和STAT3。He等[24]发现，乙型肝炎病毒HBx蛋白可以通过激活JAK2/STAT3信号通路引起肾小管上皮细胞凋亡，这可能是乙肝病毒相关肾病的发病机制之一。Erkasap等[25]发现，单独应用白藜芦醇后，短时间内可观察到TNF-α水平升高，导致STAT-1和STAT-3表达增加。如果将白藜芦醇和瘦素联合应用，则可以降低TNF-α水平，可观察到肾小管上皮细胞凋亡减轻。一项最新的研究[3]表明，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)激动剂AICAR 通过抑制JAK2/STAT1途径减轻顺铂造成的急性肾损伤。但也有学者[26]发现，白细胞介素-22可以使磷酸化的STAT3水平增加，发挥抗凋亡作用，减轻小鼠缺血再灌注损伤导致的肾损害。这提示JAK/STAT信号异常激活才会引起肾小管上皮细胞凋亡。

2.2.3 PI3K-Akt信号通路 Akt(又称作蛋白激酶 B 或 PKB)是一种原癌基因，它在调控各种不同细胞功能(包括代谢、生长、增殖、存活、转录以及蛋白质合成)方面发挥重要作用，已经成为医学界关注热点之一。PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，其活化后的产物磷脂酰肌醇3, 4, 5-三磷酸(PIP3)可作为第二信使激活Akt和其他下游因子。研究表明，PI3K-Akt信号通路在肾小管上皮细胞发挥抗凋亡作用。糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)是PI3K-Akt信号通路的一个下游分子，它的Tyr216残基被磷酸化后其活性被激活，Ser9残基被磷酸化后其活性被抑制。GSK-3β活性增加后，可能是通过抑癌基因p53介导肾小管上皮细胞凋亡。Long等[27]发现，用冲击波处理肾小管细胞后，可观察到自噬现象发生，被磷酸化的Akt及GSK-3β(ser9)明显增加；而敲除自噬相关基因后，Akt/GSK-3β途径被抑制，细胞凋亡也增加，提示在某些病理条件下，自噬现象可以通过Akt/GSK-3β途径减少凋亡，发挥细胞保护作用。

综上所述，凋亡是细胞在内外微环境改变时，以caspase激活为主要特征，多种途径、多个细胞器共同参与的一种调控性细胞死亡。肾小管上皮细胞凋亡机制是精细而复杂的，涉及到多种蛋白如Bcl-2蛋白家族、死亡受体、caspase及多条信号通路如MAPK、JAK-STAT、PI3K-Akt等的激活，各种蛋白及信号通路间相互作用，共同决定凋亡发生与否,这有利于维持肾小管的动态平衡，但也为相关的科学研究带来巨大困难。探究肾小管上皮细胞凋亡的分子机制，进而研究可以通过该机制减轻凋亡的基因或药物，可能为临床治疗肾脏疾病带来新的突破。