不同浓度葛根素对G6PD缺乏症患者红细胞的溶血率及H2O2耐受力影响

陈旖鹛，黄思聪，蔡志涛，李万根，嘉红云

(1广州医科大学附属第二医院,广州510260；2东莞康华医院)

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症作为全球常见的遗传性人类酶缺乏病，是引起溶血性疾病的重要原因。当G6PD缺乏症者服用具有氧化作用的药物或食物时，可引起红细胞内的谷胱甘肽(GSH)严重降低，导致胞膜蛋白氧化损伤而诱发溶血，严重者可发生昏迷甚至休克[1]。葛根素注射液由于具有扩张冠状动脉、改善缺血心肌的代谢[2]、降血糖血脂[3]等众多药理作用，是目前心血管疾病、2型糖尿病等慢性病患者常用的中成药注射用制剂[4]。Wang等[5]曾报道多个由葛根素注射剂诱发的急性溶血案例，但现阶段暂时没有绝对证据证明葛根素诱发G6PD缺乏症溶血的报道，我们在临床中观察到两例糖尿病合并G6PD缺乏者使用含葛根的中药方剂治疗糖尿病时出现严重溶血现象[6,7]，同时有报道[8]称高浓度的葛根素会通过改变鼠红细胞跨膜蛋白而导致溶血的发生。鉴于此，本研究中我们首先观察了不同浓度葛根素对G6PD缺乏症患者红细胞溶血率的影响 ，然后用不同浓度H2O2溶液模拟氧化损伤因素诱发G6PD缺乏症患者红细胞溶血，探讨葛根素对G6PD缺乏症患者红细胞溶血率的影响及不同浓度葛根素对红细胞H2O2耐受力的影响

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择广州医科大学附属第二医院门诊2018年2～10月G6PD缺乏症患者15例(观察组)，均符合《第4版临床检验操作规程》中的诊断标准，男6例、女9例，年龄24～48岁，G6PD活性(0.26±0.08)U/L，血清铁及总胆红素正常，总胆固醇2.7～5.0 mmol/L，甘油三酯<143 mg/dL；6例男性血红蛋白(Hb) 110～156 g/L、MCV 82～96 fL，9例女性Hb 98～124 g/L、MCV 85～92 fL。排除白血病、肿瘤、慢性肾病、SLE、急慢性血管内溶血疾病等。另随机选取10例G6PD酶活性正常的健康体检者为对照组，男6例、女4例，年龄23～49岁，G6PD活性(3.95±0.89 )U/L,血清铁、总胆红素、胆固醇、甘油三酯、Hb水平均正常。两组性别、年龄比较，P均>0.05。

1.2 加入不同浓度葛根素注射液后两组红细胞溶血率的检测 空腹抽取患者肘静脉血，用0.9%氯化钠注射液洗涤后，配制成5%的红细胞悬液。以加入0.9%氯化钠注射液的红细胞悬液为阴性对照管，以加入蒸馏水的红细胞悬液为阳性对照组。在观察组和对照组红细胞悬液中，分别加入浓度为1.15、1.35、1.55、1.75、1.95、2.15、2.35、2.55、2.75、2.95、3.15、3.35 mg/mL的葛根素注射液(新乡东升制药有限公司，批号1611/5111)，37 ℃孵育1 h后，1 500 r/min离心10 min，分光光度计在545 nm处测定各管上清液的吸光度(A)值，计算溶血率，溶血率=(A药物-A阴性对照)/(A阳性对照-A阴性对照)×100%；观察两组开始溶血的浓度，开始溶血标准为溶血率大于5%。

1.3 不同浓度葛根素注射液对G6PD缺乏症患者红细胞H2O2耐受力的检测 取观察组红细胞悬液分别加入加入终浓度为1.15 mg/mL的葛根素注射液(葛根素组)，0.9%氯化钠注射液(NS组)。两组分别加入浓度为8.1、9.0、9.9、10.8、11.7、12.6、13.5 mg/mL的H2O2溶液，37 ℃孵育1 h后，1 500 r/min离心10 min，测定溶血率。另取洁净试管，以8.1 mg/mL的H2O2与观察组红细胞混合诱发溶血，同时分别加入浓度为0.6、0.75、0.90、1.05、1.20、1.35、1.50 mg/mL的葛根素注射液，37 ℃孵育1 h后，1 500 r/min离心10 min，测定溶血率。

2 结果

2.1 不同浓度葛根素注射液加入后两组红细胞溶血率比较 观察组加入葛根素注射液后，开始溶血时葛根素注射液浓度为(1.48±0.18)mg/mL，低于对照组的(1.69±0.21)mg/mL(t=2.622，P=0.015)。加入1.15、1.35、1.55、1.75、1.95、2.15、2.35、2.55、2.75、2.95、3.15、3.35 mg/mL的葛根素注射液，观察组的溶血率分别为2.89%、4.74%、7.51%、13.62%、29.67%、49.66%、73.47%、85.70%、89.92%、95.11%、96.40%、96.88%，对照组分别为1.32%、2.12%、5.17%、5.92%、15.97%、21.25%、27.75%、38.70%、57.75%、71.32%、81.97%、88.98%，从加入的葛根素注射液浓度为1.75 mg/mL开始，随着葛根素的增高，同一葛根素注射液浓度下观察组溶血率高于对照组(P均<0.05)。

2.2 不同浓度葛根素注射液对G6PD缺乏症患者红细胞H2O2耐受力的影响 葛根素组加入浓度依次为8.1、9.0、9.9、10.8、11.7、12.6、13.5 mg/mL的H2O2溶液后溶血率分别为9.89%、12.49%、17.36%、25.03%、31.62%、42.08%、47.48%，NS组分别为10.43%、12.52%、20.73%、31.70%、44.76%、53.12%、65.33%。从H2O2浓度为9.9 mg/mL开始，随着H2O2浓度递增，葛根素组及NS组的溶血率均上升；在同一H2O2浓度下，葛根素组的溶血率均低于NS组(P均<0.05)。H2O2与观察组红细胞混合诱发溶血，同时加入浓度依次为0.6、0.75、0.90、1.05、1.20、1.35、1.50 mg/mL的葛根素注射液后溶血率分别为6.11%、5.95%、7.28%、11.81%、18.91%、29.48%、40.59%。观察组中，葛根素注射液浓度在0.6～0.9 mg/mL之间的溶血率比较，P均>0.05，而从葛根素注射液浓度为1.05 mg/mL开始，G6PD缺乏症的红细胞溶血率反而随葛根素注射液浓度的增高而增高(P均<0.05)。

3 讨论

G6PD缺乏症为X连锁不完全显性遗传病，据估计目前世界上罹患G6PD缺陷者达4亿多人。G6PD缺陷的基因在我国主要分布于黄河流域以南各省，发病率为4%～20%。红细胞对氧化损伤的耐受能力很大程度上依赖于NAPDH的还原能力，其水平主要由G6PD决定，G6PD酶产生还原代谢物NADPH，具有抗氧化作用。同理，G6PD缺乏症患者意味着其红细胞容易受到氧化损伤的打击而造成严重溶血。葛根素广泛应用于缺血性心脑血管病、糖尿病的治疗[4]，目前主要以注射剂的形式使用。由于葛根素的短消除半衰期和口服生物利用度差，经常需要频繁注射，随着临床的广泛应用，发现该药有溶血、过敏和肝、肾损害等严重不良反应，其中最严重的不良反应报告以急性血管内溶血为主。虽然近年有学者发现聚乙二醇二氧化硅纳米颗粒作为一种缓释给药系统，可延长葛根素半衰期和提高药物生物利用度，改善血液相容性低溶血，减少由葛根素引起的溶血不良作用，但距离实际临床应用尚有一段距离。由于目前学界内还没有常规针对葛根素血药浓度的检测方法，因此，对葛根素注射液在临床上的安全应用浓度目前还没有共识。G6PD缺乏症患者红细胞稳定性不如正常细胞，前文提及临床上我们观察到2例G6PD缺乏者在使用含葛根素的方剂治疗2型糖尿病时出现了严重的血管内溶血[6,7]，由此引发我们探讨葛根素注射液对G6PD缺乏者红细胞溶血的影响。

本研究结果发现，G6PD缺乏症患者红细胞对递增浓度的葛根素注射液抵抗力要低于正常红细胞，且溶血度更高。葛根素注射液除了葛根素之外，主要辅料为丙二醇，根据既往文献显示，丙二醇的溶血危险来自高渗引发的红细胞骨架破坏，而5%～10%的丙二醇溶液并不能引发细胞溶血，一般临床使用的葛根素注射液，其辅料丙二醇的浓度远达不到高渗溶血的程度，因此我们认为葛根素注射液对红细胞的溶血作用还是主要由葛根素引发。G6PD缺乏患者红细胞膜蛋白本身的稳定程度由于GSH含量下降而远低于正常红细胞，同时研究[8]显示葛根素对正常红细胞的溶血作用主要是一种非氧化性红细胞毒性反应，通过消耗细胞质ATP直接或间接诱导血液毒性，引起溶血发生前红细胞膜蛋白的降解;而G6PD缺乏的红细胞由于膜蛋白的不稳定性，相对正常红细胞来说，对葛根素的耐受程度更低，因此高浓度的葛根素引起G6PD患者急性溶血的风险会相对更高，提示临床对G6PD缺乏的患者使用葛根素注射液时要更为谨慎。

G6PD的缺乏无法提供大当量的还原力NADPH，且无法快速转变为还原态，影响红细胞对氧化性物质的抵抗能力，而且G6PD缺乏可导致血液中GSH含量下降。GSH作为多种抗氧化酶的还原当量的提供者，其浓度下降会影响红细胞对外源氧化性物质刺激的反应。因此氧化刺激是导致G6PD缺乏者溶血的重要原因。葛根素属于黄酮类化合物，具有的多酚结构提供的活泼质子与自由基结合成较稳定的产物，因而有较强的抗氧化作用。本实验我们用H2O2溶液模拟氧化损伤因素诱发G6PD缺乏症患者红细胞溶血时，发现低浓度葛根素注射液的加入有助于提高红细胞对氧化损伤的抵抗作用，使红细胞溶血程度降低，结果与既往文献[9,10]符合。朱庆磊等[9]使用豚鼠红细胞研究葛根素的抗氧化性损伤作用时发现，在0.48～1.60 mg/mL的浓度范围内，葛根素对H2O2诱发的红细胞溶血有抑制作用，且具浓度依赖性。本研究结果显示，在0.6～0.9 mg/mL浓度范围内，葛根素对H2O2诱发的溶血并无显著影响，在1.05～1.50 mg/mL的浓度范围内，G6PD缺乏症患者红细胞的溶血率反而与葛根素注射液浓度正相关，因此认为,低浓度葛根素注射液能提高G6PD缺乏症患者红细胞对H2O2的耐受能力，但葛根素注射液浓度1.05～1.50 mg/mL时，G6PD缺乏症患者红细胞溶血加重,可能由于G6PD缺乏症患者的红细胞对葛根素的耐受力弱于正常的红细胞，因此在相近的浓度范围内，葛根素已经促使患者的红细胞发生溶血。

综上所述，与健康体检者的红细胞相比，1.75～3.35 mg/mL的葛根素注射液增加G6PD缺乏症患者红细胞溶血率，即G6PD缺乏症患者红细胞对1.75～3.35 mg/mL的葛根素注射液的耐受力减低。H2O2浓度为9.9～13.5 mg/mL时，随着H2O2浓度递增，1.15 mg/mL葛根素可使G6PD缺乏症患者红细胞溶血率降低。低浓度(0.60～0.90 mg/mL)葛根素注射液能提高G6PD缺乏症患者红细胞对8.1 mg/mL H2O2的耐受能力，但葛根素注射液浓度为1.05～1.50 mg/mL时，G6PD缺乏症患者红细胞对8.1 mg/mL H2O2的耐受能力降低。低浓度的葛根素注射液虽然能提高G6PD缺乏症患者红细胞的抗氧化作用，但由于G6PD缺乏症患者红细胞膜蛋白的不稳定因素，因此其安全用药浓度要远低于正常人，临床针对G6PD缺乏症患者使用葛根素注射液时要尤为注意预防急性溶血的发生。