猪圆环病毒3型分子生物学检测方法研究进展

李天芝，于新友

（山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600）

猪圆环病毒3型（PCV3）是圆环病毒科圆环病毒属，病毒粒子呈二十面体对称结构，无囊膜，直径大小17～20 nm，是当前已知的能自主复制的最小哺乳动物病毒之一[1]。病毒对外界环境抵抗力强，在pH为3的环境中能存活较长时间，对热具有一定的耐受力，猪群一旦感染后，很难彻底根除。PCV3不能凝集动物红细胞。对氯仿、碘酒、酒精等具有一定耐受力，苯酚、季胺类化合物、氢氧化钠和氧化剂等均可杀灭病毒[2-3]。猪是PCV3的唯一宿主，各品种和日龄猪均可感染，妊娠母猪和哺乳仔猪受到的危害较为严重。母猪感染后可表现为厌食，皮肤出现变色、丘疹、皮炎等，妊娠母猪出现繁殖障碍，产弱仔、死胎、木乃伊胎等，哺乳仔猪可变现为先天性震颤、多器官系统的功能紊乱等[4]。病猪和隐性感染猪是主要传染源。病毒随患病猪口、鼻腔分泌物及粪便排出体外，污染饲料、饮水及周边环境，通过呼吸道和消化道感染其他健康猪只，也能通过公猪精液和穿过胎盘进行垂直传播[5]。

2010年一些科研工作者报道在猪体内检测到一种新型的圆环病毒，2016年美国学者首次报道由这种病毒引起的猪病，并将其命名为PCV3，随后巴西、韩国、泰国、波兰、意大利、丹麦、德国和西班牙等国家均有相关报道，表明PCV3现已在全球养猪国家蔓延[6-9]。2017年，华南农业大学宋长绪教授报道了中国首例PCV3，随后追溯性研究表明PCV3于2015年即存在于中国猪场，此后呈现上升趋势，目前PCV3在中国广东省、山东省、河北省、辽宁省、江西省、重庆市、福建省、湖南省等地猪场均有存在[10-13]。

PCV3基因组为单股环状DNA，大小约2 000 bp，GC含量为50%，基因组结构与PCV1、PCV2相似，含有3个主要的开放阅读框（ORF），ORF1、ORF2和ORF3[14]。其中ORF1编码Rep蛋白，该蛋白与其他同属的圆环病毒PCV1和PCV2 Rep蛋白氨基酸同源性高，ORF2编码主要结构蛋白Cap蛋白，可诱导机体产生特异性免疫应答，与PCV2 Cap蛋白氨基酸同源性仅为30%，推测二者之间交叉保护性低。ORF1和ORF2分别位于正链和负链上，且复制方向相反[15]。ORF3编码蛋白功能尚不清楚。PCV3可接种单层猪肾细胞（PK-15）或猪睾丸细胞（ST）进行分离培养，但一般很难成功。本文就近年来PCV3核酸探针法、常规PCR法、套式PCR法、多种PCR、荧光PCR方法、环介导等温扩增技术6种分子生物学检测方法研究进展进行综述，以期为该病的快速诊断和防控提供参考。

1 核酸探针

核酸探针又称核酸杂交，利用核苷酸碱基顺序互补的原理，用特异的基因探针即识别特异碱基序列（靶序列）的有标记的一段单链DNA（或RNA）分子，与被测定的靶序列互补，以检测被测靶序列的技术。Phan等利用靶向PCV3的探针进行原位杂交检测猪肺脏中PCV3核酸含有情况，结果显示，在呈现弥漫性肌浆/胞浆性反应的多灶性心肌细胞、发炎小动脉中膜的平滑肌细胞和心肌中的炎症细胞（大概是巨噬细胞）中较少检测到PCV3 mRNA，在肺切片中未检测到PCV3 mRNA[16]。

2 常规PCR法

PCR是以病原核酸为模板进行病原快速的方法，较病原分离鉴定等传统的方法，检测速度快，灵敏度高，在动物疾病诊断上得到了广泛应用。郑庆礼等根据PCV3基因组序列，设计了1对引物，并对PCR的反应体系和反应条件进行优化，同时进行特异性和敏感性试验，结果显示，建立的PCR方法的最佳反应条件为总体积25µL，退火温度56 ℃，模板DNA量3 µL（1ng·mL-1），进行35个循环[17]。该PCR能特异地扩增出目的片段，长度约为381 bp。测序结果表明，PCR扩增产物正确。该PCR反应特异性强，只能扩增PCV3阳性样品，且能扩增的最低模板量为1×10-4ng·mL-1。肖琦等根据Gen Bank登录PCV3全基因组序列设了一对特异性引物，经条件优化，建立了检测PCV3的PCR方法，扩增片段大小为932 bp，最低的质粒检测浓度为 10 copy·µL-1，对 PCV1、PCV2、猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）的核酸进行扩增，均无PCV3目的条带出现[18]。李晓菲等根据GenBank中PCV3核苷酸序列，设计上、下游引物，建立了一种快速检测PCV3的PCR检测方法，并对该方法的特异性、敏感性进行验证，同时用该方法对临床可疑样品进行检测，并对检测结果进行测序验证，结果表明，该方法具有良好的特异性，与其他猪病病毒均无交叉反应，同时该方法敏感性高，最低检测限可达4.21×103copy·µL-1[19]。

3 套式PCR法

套式PCR，又称巢式PCR。采用两对引物扩增目的基因片段，第2对引物在第1对引物的内部设计，以第1对引物的扩增产物为模板进行再次扩增，经两轮扩增，保证的扩增产物的特异性，提高了PCR检测的敏感性。张志等根据PCV3全基因组序列，设计3条引物，建立了PCV3半巢式PCR诊断方法[20]。该法可以扩增出大小为249 bp的特异性条带，与预期大小一致，而PCV1、PCV2、PRV、PPV等对照样品均未扩增出特异性条带。对PCV3的DNA检测极限可以达到5×10-3µg·mL-1。对临床80份样品进行检测，发现半巢式PCR的阳性检出率可以达到27.5%（22/80），而常规PCR的检出率仅为6.25%（5/80）。

4 多重PCR法

多重PCR是一种特殊的PCR技术，其是在同一PCR体系中，加入多对引物，同时检测2种或2种以上的病毒DNA，具有快速、灵敏度高、高效、特异性强等优点而广泛用于临床的快速诊断。杨永宁等根据GenBank中PCV2、PCV3基因序列分别设计合成特异性检测引物，建立了鉴别检测PCV2和PCV3的双重PCR方法[21]。该方法对PCV2、PCV3、PCV2/PCV3混合物可分别扩增出300、518、300和518 bp的特异性条带，检测PRV、PPV、PRRSV、CSFV、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）均为阴性，对PCV2/PCV3混合物的检测灵敏度达2.1 ng DNA，与PCV2和PCV3单项PCR方法的符合率均为100%。季程远等根据GenBank中PCV2和PCV3的全基因组序列，设计了两对特异性引物，通过对扩增条件的优化，建立了能够同时检测PCV2和PCV3的双重PCR方法[22]。该方法可以同时扩增PCV2的266 bp和PCV3的594 bp特异性片段，而对PRV、PPV、CSFV、PRRSV和PEDV的核酸扩增结果均为阴性。对PCV2和PCV3的最低检出量均为100 copy·µL-1。韩昊莹等根据GenBank中登录的PEDV和PCV3基因组序列，分别在M基因和Rep基因高度同源保守区设计两对特异性引物，建立了检测PEDV和PCV3双重PCR方法，即可同时扩增225 bp（PEDV）和138 bp（PCV3）两条特异性片段，而该方法对TGEV、猪博卡病毒、PCV2、大肠杆菌核酸扩增均为阴性，PEDV和PCV3的最低检出量分别为428和325 copy·µL-1，且特异性强、敏感性好，为快速、高效检测PEDV和PCV3提供了技术帮助[23]。宋德平等分别根据PRV gH基因、PCV2和PCV3 ORF2基因序列，设计3对引物，通过不断优化PCR条件，建立了同时检测PRV、PCV2和PCV3三种病毒PCR检测方法，扩增3种病毒的片段大小分别为356、248和408 bp[24]。特异性和敏感性结果显示，方法特异性好，对猪德尔塔冠状病毒（PD⁃CoV）、PEDV、TGEV、PRRSV、CSFV的基因组扩增结果均为阴性，该方法对PRV、PCV3和PCV2的最低核酸检测量均为1.0×103copy·µL-1，用法对采自江西省32个猪场256份样品（肺、淋巴结、脾脏）进行检测，结果显示，PRV阳性样品104份，PCV2阳性样品有212份，PCV3阳性样品2份。贺东生等根据GenBank公布的PVC3、非典型猪瘟病（APPV）的保守基因序列，用Primer 5.0软件设计两对特异性引物，建立了同时检测PVC3和APPV的双重PCR方法，通过优化反应条件PCV3、APPV引物的最佳使用量浓度均为20µM，50.1℃为最佳退火温度，对PVC3和APPV病毒核酸分别扩增出535和869 bp特异性目的基因片段，方法特异性好，不能检测出PRV、PPV、PRRSV、A型塞内卡病毒（SVA）核酸，双重PCR检测方法对PCV3、APPV的最低检出量分别为10.2×10-4、5.0×10-3ng·µL-1[25]。

5 荧光PCR方法

荧光PCR融汇了传统PCR技术灵敏、快速、特异的特点以及光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点，检测速度快、敏感高，可直接观察扩增结果，不需要后续电泳检测扩增产物，减少了对环境气溶胶污染的可能，避免了假阳性结果。据信号基团的不同，实时荧光定量PCR可以分为染料法和探针法两种。李卓昕等利用PCR方法扩增PCV3保守区基因片段（312 bp），将其克隆到pMD18-T载体，构建重组质粒pMD18-T-PCV3作为阳性标准品质粒[26]。优化反应条件，建立定量检测PCV3的实时荧光定量PCR方法，并进行敏感性、特异性和重复性验证。结果建立的SYBR GreenⅠRealtime PCR方法的Ct值与标准品模板在4.24×101～4.24×108copy·µL-1范围内呈良好线性关系，其相关系数为0.996，斜率为-4.384。该方法特异性强，与PRRSV、口蹄疫病毒（FMDV）、猪乙型脑炎病毒（JEV）、PCV2及PRV均无交叉反应，敏感性为4.24×101 copy·µL-1，比常规PCR方法高10倍，组间和组内重复试验的变异系数均＜2%。郝占武等根据GenBank中公布的PCV3全基因组序列设计并合成1对引物，建立了基于SYBR GreenⅠ的实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测方法，以前期检测的PCV3阳性样品制备的质粒DNA为模板，绘制了该real-time PCR的标准曲线和熔解曲线分析，并进行了敏感性、特异性和重复性试验，结果表明，该方法具有良好的特异性和较高的敏感性，质粒DNA稀释至10-8后（浓度为5×102copy·µL-1）仍然可以检出，可重复性试验中各组的变异系数均＜3%[27]。李畅等根据PCV3 ORF2基因组保守序列设计合成4对引物，先使用荧光染料定量PCR法验证其能否有效扩增目的片段，并根据结果和引物对所扩增序列的交集进一步设计TaqMan探针，通过优化反应条件和反应体系建立快速检测PCV3的实时荧光定量PCR检测方法，结果显示，SYBR染料法和TaqMan探针法均能有效地扩增PCV3标准质粒以及其他阳性样品，并且对 1.29×102～1.29×109copy·µL-1的PCV3标准质粒（pMD18-T-Cap）呈现良好的线性关系，该方法的检测灵敏度为1.29×102copy·µL-1，比常规PCR的灵敏度高100倍，该方法与PCV2、猪轮状病毒（RV）、PRRSV等病毒基因以及猪链球菌、猪肺炎支原体等细菌基因均无交叉反应，具有良好的特异性，批次内重复和批次间重复试验结果显示变异系数（CV）均＜1.5%，呈良好的可重复性[28]。张志等根据PCV3全基因组为模板设计合成1对引物和1条TaqMan探针，建立了检测PCV3的实时荧光定量PCR方法，经过标准曲线分析、敏感性、特异性和重复性等一系列试验，表明该方法具有特异性强、敏感性高以及重复性好的特点，试验结果表明，阳性PCV3标准品DNA稀释10-8后（浓度为50 copy·µL-1）仍然可以被检出，不同浓度的组间和组内重复性试验结果显示变异系数均＜3%[29]。

6 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增（LAMP）方法是日本学者Notomi等发明的一种新的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术，不需要复杂的仪器设备，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果可通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，具有灵敏度高、操作简单、反应时间短、临床使用不需要特殊的仪器等优点，特别适合在现场和基层部门应用。姜辰龙等根据其PCV3 ORF2基因保守序列，设计特异性引物，并通过Bst DNA聚合酶、引物最佳浓度比例、Mg2+、dNTPs和甜菜碱浓度及反应条件优化，建立了LAMP检测方法，结果显示，59℃恒温扩增36 min即可出现梯形条带，且产物亦可通过SYBR GreenⅠ染色进行判断[30]。该方法最低检测限为 1.0×101copy·µL-1，与PRRSV、PRV、CSFV及PCV1和PCV2等均无交叉反应。检测68份呼吸道病猪淋巴结样品，PCV3阳性率占30.9%，与PCR检测结果符合率为95.6%（65/68）。李军等根据其PCV3 ORF2基因序列，设计引物，不断优化条件，建立了PCV3 LAMP检测方法，结果显示，整个反应过程可在63℃恒温条件下完成，检测速度快，1 h内可完成扩增反应，结果判定简便，依据反应管浊度值的变化情况即可判断，不需要再进行琼脂糖凝胶电泳判定结果，不需开盖，可避免气溶胶污染[31]。从基因组DNA提取到获得最终结果可在2～3 h完成。用所建方法对PCV2、CSFV、PRRSV、PRV、猪支原体的基因组扩增，方法灵敏度高，对PCV3 DNA最低检测限约为 4.39×10-4ng·µL-1，是普通 PCR的 100倍。陈如敬等根据PCV3NS基因序列，设计特异性引物，建立一种检测PCV3的LAMP扩增方法。该方法与猪其他常见病毒如PPV、PCV1、PCV2、PRV、PRRSV和CSFV不发生非特异性反应，特异性强，准确度高，适用性好[32]。敏感性实验表明，所建立的检测方法能在62℃恒温条件下60 min内完成检测反应，最低可检出76 ng·µL-1的PCV3核酸。反应结束后，无需开盖，直接根据颜色变化进行结果判定，这极大降低了污染的可能性，提高该方法的实用性。

7 小结

猪圆环病毒病是国际公认的危害养猪业健康的主要疾病之一，PCV3是新发现的病毒，其引起猪病是一种新发的猪传染病，引起了世界各国的高度重视和密切关注。当前对其研究还不够深入，处于起步阶段，对其致病机理等还不明确，鉴于PCV3相关疾病具有传播途径多、传播速度快、流行范围广等特点。现阶段主要是开展PCV3流行病学调查，以掌握PCV3流行动态及对猪群危害，防止疫情的扩散与传播。分子生物学检测方法结合猪群临床症状，可判定猪群现症感染，尽早采取措施，降低损失。为提高检出效率，可选取新鲜的病死猪肺、淋巴结、扁桃体、脑等组织样本，活猪可选取血液、精液等进行检测。

当前有多种PCV3分子生物学检测方法，但各有利弊，常规PCR方法虽然检测速度快、特异性强，但不能定量，且检测敏感性不高。多重PCR方法，虽然可检测多种疾病，但有时反应条件很难兼顾，致检测敏感性不高，容易漏检，荧光PCR方法虽然克服了常规PCR的缺陷，但仪器和探针的合成价格昂贵，检测成本比较高，不适合基层应用。LAMP方法虽然简单、方便，适合基层进行推广应用，但灵敏度太高，易出现假阳性结果。

对PCV3相关疾病无有效药物治疗，也无有效疫苗。主要靠严格健全的生物安全措施进行防控，制定标准，并严格执行，猪场做好清洁、消毒，防蚊灭蝇及灭鼠工作，规范引种，人员、物料和车辆做好消毒，减少猪群各种应激，做到营养均衡，增强猪只抵抗力，病死猪及猪场粪污规范化处理。科研工作者应加快疫苗研制开发研究。随着技术的进步，未来一定会更好地防控该病，使猪场因该病造成的损失降低，保障我国生猪产业健康发展。