猪繁殖与呼吸综合征的研究进展

刘 贺，金 晖，陈 晨，姚鹏杰，祁思霖

（1.抚顺市动物疫病预防控制中心，辽宁 抚顺 113006；2.辽宁省动物及产品检疫中心，沈阳 110115；3.朝阳市动物卫生监督所，辽宁 朝阳 122000）

猪繁殖和呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的猪RNA病毒病，该病以流产、产死胎和病弱仔猪，仔猪产出后因呼吸道疾病和继发感染常常很快死亡为特征。1987年在美国首先发现本病[1]。由于病原不明确，便称为猪神秘病（SMD），另有蓝耳病、蓝色流产、猪不孕与呼吸综合征（SIRS）等名称[2]。现在已经在大多数欧洲国家及部分亚洲国家发现，我国在1996年首先由郭宝清报告本病[3]。其造成猪的繁殖与呼吸障碍，给国内的养猪业造成了巨大的损失，严重威胁我国的动物卫生安全，对本病开展研究具有重要的现实意义。

1 病原学

PRRSV属于套式病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒属[4]。该病毒是一种直径50～70 nm有囊膜的正链RNA病毒，基因组序列已经明确。对猪的肺泡巨噬细胞具有高度嗜性。PRRSV可分为2个亚群，即欧洲型（A亚群）和美洲型（B亚群）。由于PRRS的基因突变、病毒基因重组及连续的基因异变，加之病毒株之间的竞争和免疫压力选择，PRRSV存在较大的基因变异，个别分离株的毒力、抗原性差异较大。我国发生的PRRS，经全序列测序表明是美洲型。PRRSV对寒冷具有较强的抵抗力，对高温和化学药品的抵抗力较弱。病毒在-70℃可保存18个月，4℃可保存1个月，37℃48 h，56℃45 min完全失去感染力，对乙醚和氯仿敏感。

2 临床症状及病理变化

本病自然感染潜伏期一般为14 d。临床表现为：母猪病初精神倦怠、厌食、发烧，妊娠中、后期发生早产、流产、死胎、木乃伊胎、弱胎、产奶量下降、不发情或屡配不孕。感染仔猪以2～28日龄的症状最为明显，死亡率常达80%。早产仔猪多数24 h内死亡，多表现为腹泻、呼吸困难、肌肉震颤、后肢麻痹、打喷嚏、嗜睡、耳朵发绀。剖检常见淋巴结不同程度出血和坏死变化，肺脏病变初间质增宽呈水肿状、之后出现瘀斑和实变，肝脏淤血、变性、肿大，脾脏肿大、出血性梗死，肾脏肿大、变性。育肥猪临床症状不明显，主要病变为间质性肺炎。

近年来，本病发生后常继发或并发一些病毒病或细菌病。赵国明等发现，PRRS可与猪伪狂犬病（PR）混合感染[5]。汤景元等从某规模化养殖场送检的3头患病仔猪分离出了PRRSV和致病性沙门氏菌[6]。母安雄等根据猪群发病情况、临床症状、剖检和实验室检查确诊为猪流感并发PRRS[7]。陈绍柏也曾报道过猪蓝耳病（PRRS）与猪瘟混合感染[8]。

3 实验室诊断

兽医工作者和科研人员在原有的诊断方法的基础上开发了很多的新的PRRSV的诊断技术，对PRRS的预防和及时治疗具有重大的意义。

3.1 血清学检验法

3.1.1 免疫过氧化物酶单层细胞实验

免疫过氧化物酶单层细胞试验是目前常用的检验血清中PRRS抗体的方法。微量滴定板加巨噬细胞，5%CO237℃孵育18～24 h，将含105TCID50（半数组织培养感染量）·mL-1的病毒悬液50µL加入每孔，5%CO237℃孵育18～24 h，弃去培养液，用盐水冲洗培养板，置37℃干燥45 min后-20℃冷冻45 min。玻片上黏附的细胞用含4%多聚甲醛PBS处理，室温放置10 min，盐水冲洗。加入1∶10稀释的被检血清（稀释用含4%马血清和0.5%吐温-80的0.2 M NaCl），37℃孵育1 h，冲洗。加入兔抗猪HRPO结合物50µL，封板37℃孵育1 h。显色液/底物（AEC）染色镜检，血清内存在抗体，则巨噬细胞胞质被染成深红色[9]。

3.1.2 酶联免疫吸附实验

有研究报道，用酶联免疫吸附实验（ELISA）取代IPMA，该方法敏感性、特异性和符合率均高于IPMA。法国已将ELISA作为检测和诊断本病的常规方法。徐引弟等采用IDEXX公司生产的ELISA试剂盒对湖北、湖南、福建、浙江等省的大中型猪场猪生殖与呼吸综合征（PRRS）的流行情况进行了血清学检查，都检查出了很高的阳性率[10]。目前开发的试剂盒采用的欧洲型或美洲型病毒，或者采用这两种抗原，具有迅速处理大批血清样品的特点。

3.1.3 间接荧光抗体实验

尽管现在无一个标准的公认的免疫荧光检测方法，但在北美洲的实验室研发出若干方案并已被采用。1～10周龄仔猪感染后7 d产生抗体，8 d IFA 滴度在 1∶20～1∶320，4周均为阳性，滴度＞1∶2 560，而且大部分猪的抗体滴度至少为1∶1 280。尹训南等用IFA对人工接种PRRSV的8头30日龄猪进行体内定位检测，结果表明，特异性荧光细胞出现的频度、数量及荧光度以肺脏最为明显，特异性荧光主要出现在巨嗜细胞及血管内皮细胞的胞浆中。值得关注的是，不同实验室IFA判断标准会有不同，在一定程度上检测结果判定取决于所用的毒株。

3.2 PCR检测方法

3.2.1 反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测法

有研究用RT-PCR建立一种直接检测PRRS病毒的方法。以RT-PCR法扩增从西班牙分离的7株病毒的312 bp片段，进行克隆和测序，有96%～97%序列与PRRSV的核甘酸序列相同。有研究用PCR法能检测出在细胞培养物中，或精液中30个感染单位（TCID）的PRRS病毒。Guarino等根据美洲株的（ATCCVR-2332）的ORFs4、6、7和Lelystad毒株的ORF1b设计了6对引物，对来自美洲的24个PRRS病毒进行了RT-PCR的扩增，其中保守性强的ORF7基因检出率为100%。Madsen等用RT-PCR方法对分离自丹麦某猪场的血清进行检测，通过对病毒核甘酸序列ORF2-ORF7的分析发现，其序列与VR-2332序列的同源性为99.2%～99.5%，从而判定此株病毒是PRRSV的一种变异株[11]。徐宜强等参考国内外已发表PRRSV的基因序列及相关的RT-PCR检测方法报道，根据PRRSV高度保守、高特异性的NP蛋白基因设计了一对引物，建立了PRRSV RT-PCR检测方法[12]。

3.2.2 逆转录环介导恒等温扩增实验

LAMP是由Notomi等发明的一种用于病毒检测的核酸扩增技术，因其敏感、高效和便捷，被应用到很多常见疫病的检测[13]。邓显文等利用NSP2基因的RT-LAMP检测方法，敏感性高于常规PCR10倍[14]。曾少灵等构建的美洲型PRRSV及其高致病性变异株RT-LAMP检测方法应用检测58份病料，其结果与实时荧光RT-PCR方法检测符合率100%[15]。该方法操作简单且易于判定，适合基层和现场开展检测，但是其气溶胶污染值需高度关注，应做好检测环境分区和定期通风，避免假阳性出现。

3.2.3 数字PCR

数字PCR是基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，不依赖Ct值或内参基因，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。其采取分析化学领域的微流控方法，将大量稀释后的DNA溶液分散至芯片的微反应器中，每个反应器的DNA模板数≤1个，这样经过PCR循环之后，当不存在任何靶标序列时，没有信号累积，进而推算出原始溶液的DNA浓度。数字PCR为PRRSV酸检测方面提供了新的检测平台，亟待利用该平台构建新的检测方法。

4 防治

4.1 PRRS疫苗

近年来，PRRS的灭活苗、弱毒苗和基因工程苗的研究取得了很大的进展，并通过合理的选择和使用免疫佐剂，如γ干扰素，霍乱毒素及可溶性β-葡萄糖等来改进疫苗的作用。Planadurán等报道，应用西班牙毒株研制成一种灭活苗，对后备母猪和母猪进行两次免疫，有很好的保护作用[16]。灭活苗存在安全性，但是存在使用剂量大、成本高的问题。Schering-Plough公司发明了用于能繁母猪配种前3～6周使用的的弱毒苗[17]。弱毒疫苗在给猪群接种后，不仅可导致猪的病毒血症，而且还可能通过分泌物向外排毒[18]。Clung等提出接种公猪可通过精液排毒[19]。更为严重的是，弱毒株的疫苗会发生返祖现象，转变为强毒株，1996年丹麦弱毒苗免疫的猪群爆发PRRS[20]。因此，弱毒苗对PRRS阴性场、妊娠母猪、种公猪禁止使用。正因为弱毒苗和灭活苗存在这样和那样的问题，科研人员研发了采取腺病毒或伪狂犬病病毒为载体来表达PRRSV的主要免疫源性特性的多价基因工程苗和针对PRRSV GP5蛋白的DNA疫苗及优化的疫苗，为PRRS安全防控提供了新的技术手段。

4.2 饲养管理与环境控制

应提高日粮营养水平，保证维生素（VE，生物素）、矿物质5%～10%（Fe、Ca、I、Se、Mn等）含量，注意氨基酸的平衡。保持环境卫生，消毒彻底，防止PRRSV再次感染。注意保温，当温度过低、过高、风速大和紫外线照射强度过大时，PRRS传染和传播的几率会增大。后备母猪和育成猪混合饲养，或者隔离不彻底，可能引起交叉感染。做好引种隔离、人员流动控制和血清学监测，有助于预防本病。