温经止痛方对子宫内膜异位症模型大鼠AKT/mTOR信号通路的影响

黄艳辉，冯 丹，丑 丹，刘 佳，祁 慧，刘雯雯，王 静

(武汉市中医医院妇科，武汉 430010)

子宫内膜异位症(endometriosis，EMS)，简称内异症，是妇科领域中的多发病、疑难病，其进行性加重的盆腔粘连、疼痛和不孕对女性生理和心理造成了极大的负担，传统药物治疗手段效果欠佳、不良反应明显，复发率高，严重影响了女性的生殖健康和生活质量，因此防治EMS一直是妇科领域的研究重点。

AKT/mTOR信号通路是被研究最多的细胞膜受体信号转导通路之一，在促进细胞增殖、抗细胞凋亡、以及促进新血管生成方面发挥重要作用[1]。Li等[2]经研究证实，激活的AKT通路可以上调增殖细胞核抗原、抗凋亡分子、生存素、粘附相关分子、整合素b1和整合素avb3的表达，促进异位内膜细胞的增殖、粘附和侵袭。亦有研究发现，异位内膜PI3K/AKT信号转导通路磷酸化，增强VEGF的表达，促进异位内膜的浸润和种植，推动EMS的发生和发展。[3-4]。

本课题组前期研究表明，温经止痛方治疗EMS，取得较好临床疗，可明显缓解患者痛经、慢性盆腔痛、性交痛，改善生育能力，促进妊娠等[5]。本研究以AKT/mTOR通路为切入点，深入探讨温经止痛方治疗EMS的机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级雌性成熟未交配过的Wistar大鼠120只，体重200～250 g，鼠龄8～12周，均购于湖北省实验动物研究中心[SCXK (鄂) 2015-0018]，无菌手术在武汉市中医医院药学基地动物实验室进行[SYXK (鄂) 2016-0056]，动物实验经由实验动物管理委员会批准，审批号：L20170001，实验动物使用按照3R原则给予人道的关怀照顾。

1.2 主要试剂与仪器

实验药物：温经止痛方：当归15 g、桂枝10 g、赤芍15 g、细辛3 g、炙甘草6 g、吴茱萸3 g、炮姜10 g、黄酒75 mL等组成，购自武汉市中医医院药房(天济中药饮片公司)，于我院制剂室煎煮浓缩，具体步骤如下：中药生药按上面处方比例调配总计21.59 kg，分为两锅，加水10倍，煎煮2次，第一次30 min，第二次20 min，合并滤液，加入黄酒7瓶，浓缩至8.5 L，加入防腐剂放入冰箱备用；孕三烯酮(每粒2.5 mg，北京紫竹药业有限公司生产)。

TRIzol，Invitrogen公司提供(15596018)；ReverTra Ace® qPCR RT Kit及SYBR® Green Real-time PCR Master Mix，购自Toyobo公司(561800，642800)；兔抗AKT、mTOR多克隆抗体浓缩液及Biotin-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit，购自武汉三鹰生物技术有限公司(20657-1-AP，10176-2-AP，SA00004-2)；ELISA试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司(CSB-E08008r，CSB-E08005r)。

电泳仪购自北京六一仪器厂(DYY-6C)；定量PCR反应扩增仪购自ABI公司(7900HT)；紫外分光光度计购自上海析谱(UV-2202)；移液器购自法国Gilson公司；脱水机、包埋机购自武汉俊杰电子有限公司；病理切片机购自上海徕卡仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 建立内异症动物模型

参考Jones手术移植改良方法建立模型[6]，120只雌性成熟Wistar大鼠，定时进行阴道涂片检查，选择动情期造模。手术在无菌条件下进行，麻醉大鼠后，将大鼠固定于手术板上，腹部剪毛，皮肤消毒后，在尿道上端约2 cm处，沿腹部中线切开约3 cm的切口，找到左侧子宫，分离附着于子宫肌壁的脂肪和结缔组织后，在离卵巢约l cm处剪取长2 cm子宫，断端结扎。将所取子宫组织置于洛氏营养液中，剪取约0.5 cm × 0.5 cm大小3块内膜，分别缝于子宫分叉处、右卵巢附近，缝合切口，常规饲养。假手术组采用相同大小的大网膜脂肪作移植物，其余处理措施同上。建模4周后，择动情期开腹，再次观察移植物生长情况。造模成功的标志为：移植物体积增大，并形成内有液体积聚、表面有血管攀生的透明小泡，同时取移植物送病检证实内膜成活，证明建模成功。

建模后每组选取2只观察移植物生长情况；在建模及饲养过程中每组都有大鼠死亡，共有22只大鼠死亡。最后中药中剂量组存活最少(15只)，故每组取15只检测指标。

1.3.2 分组、给药及处理

将建模成功的大鼠称重后随机分为5组，加正常对照组(假手术组)共6组，各15只。中药高、中、低剂量组，分别给予7.4 g/mL、3.7 g/mL、1.85 g/mL的温经止痛方中药，每日1 mL/100 g灌胃。西药组：孕三烯酮胶囊0.05 mg/mL，每次1 mL/100 g灌胃，每周2次。模型组及正常组：每日生理盐水1 mL/100 g灌胃。均给药8周。

取材：各组大鼠分别于最后一次灌胃24 h后麻醉后腹主动脉取血，分离血清，-20℃保存待测，再用两脚规测量移植物的体积：长(cm)×宽(cm)×高(cm)。取下在位子宫内膜及子宫分叉处、右卵巢附近部位的移植病灶，-80℃冰箱冻存备检。

1.3.3 HE染色

组织固定切片脱蜡后，常规染色光镜下进行组织病理学观察。

1.3.4 实时定量PCR法检测异位、在位内膜上AKT、mTOR mRNA的表达水平

荧光定量PCR采用TRIzol法提取RNA，将得到的RNA于BioTek ELx808酶标仪上行纯度及浓度的测定，按反转录试剂盒(Toyobo公司)进行逆转录后于Roche定量仪器上，按免疫荧光定量试剂盒(Toyobo公司)进行定量，双△Ct法计算相对表达量。引物由武汉金开瑞生物工程有限公司合成。引物序列均为5’→3’方向见表1。

1.3.5 免疫组化法检测AKT、mTOR蛋白的表达

采用第二代免疫组化Elivision二步法检测。一抗分别为兔抗AKT、mTOR多克隆抗体浓缩液，二抗为偶联生物素的抗兔抗体(均购自武汉三鹰生物技术有限公司)。PBS代替一抗作阴性对照，AKT用已知的阳性表达的胰脏切片做阳性对照，mTOR用已知阳性表达的肝组织切片做阳性对照。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.6 采用ELISA检测大鼠血清各细胞因子

ELISA法检测VEGF的含量，严格按照试剂盒说明书进行。所有标本在一批内测定，批内误差< 10%。

1.4 统计学方法

图1 模型大鼠异位灶Figure 1 Ectopic focus of endometriosis in a model rat

2 实验结果

2.1 EMS模型大鼠移植物的组织学形态

建模4周后，择动情期开腹，观察子宫内膜异位种植生长情况，发现腹膜表面的移植物生长欠佳，卵巢表面及子宫分叉处移植物生长非常良好，移植物体积增大，并形成内有液体积聚、表面有血管攀生的透明小泡，见图1。HE染色结果显示，EMS模型大鼠的异位内膜组织与正常子宫内膜的组织学形态基本相似，异位内膜组织的内膜下层变薄，腺体减少甚至消失，肌层变薄并出现纤维化，没有明显的外膜，仅有一些纤维组织包裹。见图2。

2.2 免疫组化检测AKT、mTOR在各组在位、异位内膜上表达情况

AKT主要在子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的细胞核、细胞质、细胞膜中表达，mTOR主要在子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的细胞质和细胞核中表达，如图3～4。EMS模型组异位内膜、在位内膜上AKT、mTOR的蛋白表达水平明显高于正常对照组在位内膜(P< 0.01)，见表2～3。

注：A：在位内膜；B：异位内膜。图2 EMS模型大鼠在位和异位内膜的组织学形态(HE染色，× 100)Note. A: Eutopic endometrium; B: Ectopic endometria.Figure 2 Histological features of eutopic and ectopic endometria in EMS model rats. HE staining

注：A：正常组在位内膜；B：西药组在位内膜；C：中药高剂量组在位内膜；D：模型组异位内膜；E：西药组异位内膜；F：中药高剂量组异位内膜。图3 大鼠在位及异位内膜AKT的表达情况(免疫组化染色，× 100)Note. A: Eutopic endometrium in the normal group. B: Eutopic endometrium in the Nemestran group. C: Eutopic endometrium in the WJZT high-dose group. D: Ectopic endometrium in the model group. E: Ectopic endometrium in the Nemestran group. F: Ectopic endometrium in the WJZT high-dose group.Figure 3 Comparison of AKT protein expression in the rat eutopic and ectopic endometria of different groups. Immunohistochemical staining

注：A：正常组在位内膜；B：西药组在位内膜；C：中药高剂量组在位内膜；D：模型组异位内膜；E：西药组异位内膜；F：中药高剂量组异位内膜。图4 大鼠在位及异位内膜上mTOR的表达情况(免疫组化染色，× 100)Note. A: Eutopic endometrium in the normal group. B: Eutopic endometrium in the Nemestran group. C: Eutopic endometrium in the WJZT high-dose group. D: Ectopic endometrium in the model group. E: Ectopic endometrium in the Nemestran group. F: Ectopic endometrium in the WJZT high-dose group.Figure 4 Comparison of mTOR protein expression in the rat eutopic and ectopic endometria of different groups. Immunohistochemical staining

表2 免疫组化检测六组EMS模型大鼠异位、在位内膜上AKT的表达比较(n=15)Table 2 Comparison of AKT expression in eutopic and ectopic endometria of the six groups of EMS model rats by immunohistochemistry

注：与模型组在位内膜比较，**P< 0.01；与模型组异位内膜比较，##P< 0.01。
Note. Compared with eutopic endometrium of the model group,**P< 0.01. Compared with ectopic endometrium of the model group,##P< 0.01.

表3 免疫组化检测六组EMS模型大鼠异位、在位内膜上mTOR的表达比较(n=15)Table 3 Comparison of mTOR expression in in eutopic and ectopic endometria of the six groups of EMS model rats by immunohistochemistry

注：与模型组在位内膜比较，**P< 0.01；与模型组异位内膜比较，##P< 0.01。
Note. Compared with eutopic endometrium of the model group,**P< 0.01. Compared with ectopic endometrium of the model group,##P< 0.01.

温经止痛方中药低、中、高剂量组在位内膜、异位内膜上AKT、mTOR表达水平逐渐减弱，中药中、高剂量组在位内膜及中药高剂量组异位内膜上AKT、mTOR明显低于模型组(P< 0.05)。西药组在位内膜上AKT亦明显低于模型组(P< 0.05)。见表2～3。提示EMS模型组大鼠在位内膜、异位内膜上AKT、mTOR表达水平升高，温经止痛方中药可使EMS模型大鼠在位内膜、异位内膜上AKT、mTOR蛋白表达水平下降，中药高剂量组效果最佳。

2.3 Real-time PCR法检测AKT、mTOR mRNA在各组大鼠在位、异位内膜上表达情况

分别提取在位内膜及异位内膜的总RNA及蛋白，用实时定量PCR法检测AKT、mTOR mRNA的表达。模型组在位、异位内膜AKT、mTOR mRNA表达含量高于正常对照组在位内膜，差异有显著性(P< 0.01)，详见表4。

中药高、中剂量组异位内膜AKT、mTOR mRNA含量明显低于模型组异位内膜(P< 0.05)，中药中剂量组异位内膜AKT、mTOR mRNA含量明显低于西药组异位内膜(P< 0.05)。中药高、中、低剂量组、西药组在位内膜AKT mRNA表达含量明显低于模型组在位内膜(P< 0.05)，其上mTOR mRNA表达含量亦低于模型组，但差异无显著性(P> 0.05)，详见表4。

以上数据说明EMS模型组在位内膜、异位内膜上AKT、mTOR mRNA表达含量升高，温经止痛方中药、孕三烯酮西药可使EMS模型大鼠在位内膜、异位内膜上AKT、mTOR mRNA表达水平下降。

2.4 温经止痛方对EMS模型大鼠血清中VEGF水平的影响

EMS模型组血清VEGF水平均高于正常对照组(P< 0.01)。温阳化瘀法中药高、低剂量组、西药组血清VEGF水平明显低于模型组(P< 0.01)；中药中剂量组亦低于模型组(P< 0.05)。中药高剂量组血清VEGF水平低于中药中、低剂量组，但差异无显著性(P> 0.05)，详见表5。

以上结果提示EMS模型大鼠血清VEGF水平表达升高，温阳化瘀法中药、孕三烯酮西药可使EMS模型大鼠血清VEGF水平下降，并随中药浓度升高，其对VEGF分泌的抑制作用增强。

表4 RT-PCR法检测AKT、mTOR mRNA的在各组内膜上表达情况Table 4 Expression of AKT and mTOR mRNAs in the endometria of each group determined by RT-PCR

注：与模型组在位内膜比较，*P< 0.05；与模型组异位内膜比较，#P< 0.05；与西药组异位内膜比较，▲P< 0.05。
Note. Compared with eutopic endometrium of the model group,*P< 0.05. Compared with ectopic endometrium of the model group,#P< 0.05. Compared with ectopic endometrium of the Nemestran group,▲P< 0.05.

表5 六组EMS模型大鼠血清VEGF水平的比较Table 5 Comparison of serum VEGF levels in the six groups of EMS model rats

注：与模型组比较，*P< 0.05，**P< 0.01。
Note. Compared with the model group,*P< 0.05,**P< 0.01.

3 讨论

随着研究日渐深入，证实AKT/mTOR信号通路参与子宫内膜异位症的发生、发展过程，在EMS中存在该信号通路的过度激活，并通过调节细胞自噬、凋亡因子等的表达，影响异位内膜的粘附、侵袭、血管生成及增殖凋亡等过程[7]。

近年研究发现AKT能够磷酸化内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)，其产物NO可以促进血管生成，并发现EMS患者体内eNOS表达明显升高[8]，异位病灶周围血管生成增多,可能都与AKT通路的激活有关[9-10]。Chang等[11]报道，子宫内膜间质细胞中肿瘤转移抑制因子(NME1)的异常低表达，可激活AKT通路，进而分泌大量IL-8和VEGF，促进异位病灶处血管内皮细胞的大量生成。Govatati等[12]研究发现EMS在位内膜中PTEN基因的缺失，使AKT通路过度激活，活化的AKT能够抑制Bad活性，产生抑制凋亡作用，Bad属于Bcl-2家族一员，具有促凋亡作用。

Cinar等[13]亦证实：EMS的女性在位内膜AKT信号传导通路磷酸化水平高于无EMS的女性。Annu等[14]实验证实：EMS中异位灶的粘附与生长过程涉及多条信号通路的相互作用及协调，其中AKT信号传导通路发挥了重要作用。

mTOR是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，在细胞生长中处于核心地位，其最主要的功能是调控蛋白质翻译过程。Leconte等[15]研究发现，深部浸润型EMS患者在位和异位内膜细胞的增殖率均明显升高,认为异位内膜细胞的过度增殖和mTOR/AKT通路的激活有关，而mTOR/AKT抑制剂能有效抑制异位内膜细胞的增殖。

Feng等[16]腹腔镜下观察子宫内膜异位病灶的特点为病灶周围存在大量腹膜血管，组织学检查子宫内膜异位病灶的特点为高度的血管化。因此，新生血管在EMS形成的过程中起着重要的作用。

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是最为关键的血管形成因子，可与血管内皮表面的特异性受体结合，促进血管的形成[17]。Kianpour等[18]研究发现EMS患者腹腔液及病灶中VEGF水平较正常对照组明显升高，提示异位子宫内膜病灶中VEGF的过度表达，可以增强血管的生成能力。

本课题通过动物实验，采用免疫组化及PCR检测，证实EMS模型组大鼠在位、异位内膜上AKT、mTOR mRNA及蛋白水平升高，显著高于正常空白对照组(P< 0.05)，与文献报道相符[7-12, 19]，提示AKT、mTOR异常表达与子宫内膜异位症发生、发展有关。EMS模型大鼠血清VEGF水平表达升高，提示与异位病灶的血管生成有关。而异位内膜PI3K/AKT信号转导通路磷酸化，增强VEGF的表达，导致异位内膜侵袭、种植、生长，共同促进了子宫内膜异位症的发生和发展。以上研究表明AKT/mTOR信号通路中的AKT、mTOR做为关键性的调控因子，可能在内异症的发病过程中起到“闸门”的作用。

同时实验研究表明：温经止痛方可降低子宫内膜异位症大鼠的在位内膜、异位内膜上AKT、mTOR mRNA及蛋白相对表达量，抑制AKT/mTOR信号通路，温阳化瘀法中药、孕三烯酮西药可使EMS模型大鼠血清VEGF水平下降，并随中药浓度升高，其对VEGF分泌的抑制作用增强，呈剂量依赖性。本方可影响异位内膜的粘附、侵袭，血管生成及增殖凋亡等过程；使在位子宫内膜、异位子宫内膜及腹腔局部微环境发生改变，抑制异位内膜生长；从而达到治疗EMS目的。如能进一步研究其通路确切机制及上下游相关因子，可促进研发靶向作用更强、临床疗效更好的中西药。